Способ получения ферментного препарата l лизиндекарбоксилазы

СОЮЗ СОНЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИН 80143398 дц 4 С 12 М 9/88, 9 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(О 00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Научно-производственное объединение "Фермент", Вильнюсский государственный университет им.В,Капсукасаи Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения(56) Глемжене И.И. и др. Микробиология и производство. Вильнюс, 1981,с.23-26.Наумчик Г,Н. и др. Особенностьтехнологии лекарственных форм ферментов микробного происхождения. - Сборник научных трудов: Химия, технология производства и медико-биологическое исследование ферментных препаратов медицинского назначения. М 1983,с.52-58.Авторское свидетельство СССРУ 1307851, кл. С 12 Я 9/88, 1985,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА Ь-ЛИЗИНДЕКАРБОКСИЛАЗЫ (57) Изобретение относится к микробиологической промьппленности, Цель изобретения - увеличение ферментативной активности и стабильности. Для получения ферментного препарата лизиндекарбоксилазы - аналитической композиции - проводят глубинное культивирование бактерий ЕзсЬегхсМа со 1 д МКЕ 600 в питательной среде, содержащей, мас.Х: глюкоза 0,35-0,4; пелтон 0,09-0,11; лизин кормовой кристаллический 0,78-0,82; натрий фосфорнокислый двуэамещенный 0,22-0,24; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,52- 0,54; натрий хлористый 0,09-0,11, Выращивание проводят в анаэробных условиях без насыщения питательной среды воздухом и ее перемешивания при рН 6,0о6,2 и температуре 30-32 С до достижения оптической плотности культуральной жидкости, 0,4-0,45 (540 нм, 0,5 см) Отцентрифугированную биомассу ацетонируют 4-6-кратным объемом ацетона. Ацетонированные клетки смешивают с безводным однозамещеннымфосфатом натрия,двузамещенным фосфатом натрия, растворимым крахмалом, глюкозой, стеаратом кальция в соотношении, мас.7.: 12:45,4:3,2 :30,4:8:1 соответственно, и таблетируют при давлении, обеспечивающем распадаемость таблеток в воде при 40 - 50 С в течение 0,5-1,0 мин. 1 ил.2 табл.Изобретение относится к микробиологической промьппленности, в частности к производству Ферментов, и каса- ется получения ферментного препарата лизиндекарбоксилазы - аналитической композиции, используемого в качестве реагента для определения концентрации Ь-лизина в растворах при работе автоматического Ь-аминокислотного анализатора,Цель изобретения - увеличение ферментативной активности и стабильнос 5 10 1,3 раза при применении 250-литровых ферментеров и в 3 раза при укрупненном производстве с применением 1500" литровых ферментеров. Кроме значительного повьппения лизиндекарбоксилазной активности в последнем случае 40 в препарате отсутствует индуцируемаяглутаминовой кислотой, которую содержит пептон, глутаматдекарбоксилазнаяактивность, появляющаяся в аэробныхусловиях.Улучшение условий техники безопасности при ацетонировании биомассы достигнуто путем применения меньшего (в 4 раза) количества ацетона (легко возгорающейся жидкости) взамен его 18-20-кратного объема, а также отка.50 за от промывания ацетонированной биомассы ацетоном и эфиром, обладающимсильным наркотическим действием,При этом лизиндекарбоксилазная активность ацетонированных клеток повьппается в 1,3 раза, а стабильность прихранении - в 1,5 раза. ти.На чертеже показана зависимость 15 остаточной лизиндекарбоксилаэной активности биомассы, высушенной разными способами, от продолжительности хранения, где кривая 1 - биомасса, обработанная ацетоном и эфиром (по 20 известному способу); кривая 2 - биомасса обработанная ацетоном без эфиФра (по предлагаемому способу).Способ заключается в том, что понижение в 2 раза концентрации пепто на и глюкозы в питательной среде, отказ от насьпцения воздухом питательной среды и перемешивания культуральной жидкости во время Ферментации, сужение интервала температуры выра щивания биомассы до 30-32 взамен 30 о34 С и укорочение времени культивирования бактерий до 3-3,5 вместо 4 - 5,5 ч позволяет повысить лизиндекарбоксилаэную активность препарата в Компоненты препарата лиэиндекарбоксилаэы - аналитической композиции - ацетонированная биомасса клеток продуцента лизиндекарбоксилазы, одно- и двузамещенные фосфаты натрия,растворимый крахмал, глюкоза и стеарат кальция в соотношении, мас.%: 12:45, 14;3, 2:30, 4;8:1, позволяют получить при помощи таблеточного пресса таблетки, растворяющиеся в 1 мл анализируемой жидкости при 40-50 С и перемешивании в течение 0,5-1,0 мин с образованием буферного раствора с рН 5,5 и лизиндеркабоксилазной активностью не менее 4 ед/мл, т,е, обладающие свойствами, необходимыми при работе автоматического анализатора лизина при серийных анализах.П р и м е р, Музейную культуру перассевают на 2%-ный мясо-пептонный агар (МПА) в чашки Петри и инкубируют в термостате при 30 С 24 ч. Оживленную культуру пересевают на косяки МПА в 30 пробирках и инкубируют при 30 С 24 ч. Культуру, выросшую на косяках, далее выращивают в среде объемом 3,750 л, содержащей, мас,%; глюкоза 0,4; пептон 0,1; кормовой лизин кристаллический 0,8; натрий Фосфорнокислый двузамещенный 0,23; калий однозамещенный фосфорнокислый 0,53; натрий хлористый 0,1, рН среды 6,4. При подготовке среды раствор глюкозы стерилизуют при 0,5 атм 30 мин, а смесь растворов остальных компонентов - при 1 атм 20 мин. Куль.отуру инкубируют при 30 С 5 ч и используют для приготовления инокулята в сателлите, содержащего 37,5 л питательной среды того же состава. Инокулят выращивают при 32 С до оптической плотности 0,8 при 540 нм и толщине слоя 0,5 см, Инокулят засевают в ферментер объемом 1500 л, содержащий 710 л питательной среды с рН 6,3. Ферментацию проводят прио31 С без перемешивания и подачи воздуха со свободным падением рН до 6,0 до образования оптической плотности среды 0,4 при 540 нм и толщине слоя 0,5 см. Суспенэию клеток охлаждают до 10 С и биомассу отцентрифугируют при 17000 об/мин. Получают 900 г сырой биомассы. Измеряют активность биомассы после ее дезинтеграции ульт. развуком при следующих условия: рН 5,7, 37 С концентрация субстрата 0,05 М, пиридоксальфосфата О,Р 5 мМ, 1433981Лиэиндекарбоксилазная активность биомассы составляет 10 ед/мг сухого вещества, удельная активность 32 ед/мгбелка, глутаматдекарбоксилазная ак 5тивность не обнаруживается.Ацетонирование биомассы проводятпорциями по 70 г. К навеске биомассыдобавляют 10 мл физиологическогораствора и в ледяной бане размешива Оют до получения однородной суспензии;в которую при перемешивании приливаОют 350 мл охлажденного до +4 С ацетона, перемешивают,10 мин, фильтруютна вакуум-фильтре и высушивают на 15воздухе.Необходимые комоненты аналитической композиции в количестве 33 г ацетонированных клеток, 124,8 г натрияфосфорнокислого однозамещенного, 208,1 г фосфорнокислого двузамещенного,83,6 г растворимого крахмала, 22 гглюкозы, 2,75 г стеарата кальция перемешивают до образования однородноймассы и таблетируют на прессе ПЛТ25с пресс-инструментом 5 мм. Применяется такое давление прессования, прикотором время распадаемости таблеткиов 1 мл воды при 42 С и перемешиваниине превышало 1,0 мин, 30Значение рН образовавшейся суспензии соответствует 5,5 лизиндекарбоксилазная активность - 13 ед/мл.Пример приведен при одних значениях параметров, так как в границах до пустимых колебаний результат - качество аналитической композиции - не меняется,Влияние аэрации на лизиндекарбоксилазную активность биомассы и образование сопутствующей глутаматдекарбоксилазной активности показанов табл, 1. При выращивании продуцента в 45 1500-литровых ферментерах (масштабирование около 8 раз) по предлагаемому способу лизиндекарбоксилазная активность сырой биомассы, а также после ее ацетонирования в среднем в 3 раза выше, чем по известному способу, Кроме того, в биомассе не содержится нежелательная примесь глутаматдекарбоксилазы. Это объясняется тем, что при ферментации в больших объемах, (1500 л) перемешивание и насыщение воздухом питательной среды приводит к появлению сопутствующей глутаматдекарбоксилаэной активности и снижению лизиндекарбоксилазной активности.Зависимость лизиндекарбоксилазной активности биомассы от количества ацетона показано в табл, 2,Для ацетонирования биомассы, суспендированной в минимальном количест.ве физиологического раствора в соотношении 7:1 соответственно, необходимо использовать 4-6-кратный объемацетона,Последующая обработка ацетонированной, биомассы эфиром ухудшает стабильность лизиндекарбоксилазной активности при хранении (см.чертеж).Как видно из чертежа,при хранениив течение года остаточная активностьбиомассы, обработанной ацетоном согласно изобретению, в 1,5 раза выше,чем по известному способу. Поэтомудля повышения стабильности лизиндекарбоксилазной активности следуетотказаться от досушивания ацетонированной биомассы эфиром,Использование предлагаемого способа получения ферментного препаратализиндекарбоксилазы - аналитическойкомпозиции - дает следующие преимущества:При выращивании продуцента лизиндекарбоксилазы в 1500-литровых ферментерах, т.е. при масштабированиипроцесса ферментации в 8 раз, можнополучить в 3 раза более активную биомассу.Сокращается время, знергозатратыи упрощается подготовка питательнойсреды для ферментации. Так, стерилизация растворов лизина, пептона, одно- и двузамещенных фосфатов натрия,хлористого натрия производится совместно, что особенно важно при больших объемах растворов. Для полученияпосевного материала требуется эа евкультурой 30 пробирок (вместо 60).Питательная среда не продуваетсявоздухом в течение 35 мин и не перемешивается, что позволяет экономитьвремя и энергию.Питательная среда содержит в 2 ра"за меньше глюкозы (0,4 вместо 0,8 Х)и в 2 раза меньше пептона (0,1 вмес то 0,2 ), что позволяет экономить пищевое сырье и удешевить процесс ферментации, а также исключить индуцирование глутаматдекарбоксилазной активности,1433981 Таблица 1 Объем Коли- пита- честУсловияаэрациипо спо"собу Активностьбиомассы,ед/мг тель- ной во сыройбиоГлута- матде- карбо- ксилаЛизинсреды, л декар- боксимассы, г лаза за Известному+ 900 1070, 3,2 0,54 760 2,8 0,33 650 870 10800 8 Предла гаемому 650 следы следы Отказ от насьшения воздухом питательной среды и перемешивания во вреь 1 я ферментации при ее масштабироваии в 8 раз позволяет избежать обра 5 зования сопутствующей глутаматдекарбоксилазы.Ацетонирование биомассы проиэводится 4-6-кратным (вместо 18-20) объе ом ацетона, являющегося легко воз горающейся жидкостью (ЛВЖ), без применения эфира (ЛВЖ, сильный наркотик), ч о значительно сокращает расход мат риалов и улучшает условия техники б зопасности работающих. 15За счет изменения условий ацетонир вания биомассы стабильность лизинд карбоксилазной активности при хра-, н нии возрастает в 1,5 раза, а активн сть - в 1,3 раза. 20При таблетировании аналитической к мпозиции используются клетки, ацет нированные 4-6 объемами ацетона, ч о позволяет избежать значительной ( о 40 ) инактивации ферментативной 25 а тивности, которая обычно происходит прн таблетировании ферментов.Применение ферментного препарата - аналитической композиции - позволяет автоматизировать процесс выполнения 30 анализов. Препарат предназначен в к честве реактивов для серийных аназов, выполняемых при помощи автоматического анализатора лизина, в противоположность препарату лизиндекфрбоксилазы; полученному по известиму способу и используемому для одиночных Анализов, выполняемых вручную. Сстав и соотношение компонентов аналитической композиции позволяет обес почить необходимый рН (5,5) и лизинд 4 карбоксилазную активность (не менее 4 ед/мл) в анализируемых пробах культуральной жидкости. Это позволяет исключить взвешивание на аналитических весах ферментного препарата п 1 и кажцом единичном анализе, приготовление буферов, контроль в каждой анализируемой пробе значения рН. 50формула изобретения Способ получения ферментного препарата .-лизиндекарбоксилазы путем гпубинного культивирования продуцента ЕзсЬегсМа .со 1 ИВЕ 600 в питатепьной среде, содержащей глюкЬзу, натрий фосфорнокислый двузамещенный в Количестве 0,22-0,24 мас, , калий фосфорнокнслый однозамещенный в количестве 0,52-0,54 мас, , натрий хлористый в количестве 0,09-0,11 мас. ,пептон, лизин кормовой кристаллический в количестве 0,18-0,82 мас. ,дистиллированную воду прн рН 6,0-6,2с последующим отделением клеток центрифугированием и ацетонированием биомассы, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью увеличения ферментативной активности и стабильности, процесс культивирования проводят в анаэробных условиях до достижения оптической плотности культуральной жидкости 0,4-0,45, причем количестваглюкозы и пептона устанавливают соответственно равными 0,35-0,40 и0,09-0,11 мас.%, ацетонирование биомассы ведут 4-6-кратным объемом ацетона, полученные ацетонированныеклетки смешивают с безводным однозамещенным Фосфатом натрия, двузамещенным фосфатом натрия, растворимым крахмалом, глюкозой, стеаратомкальция в соотношении, мас.%: 12:45,4:3, 2:30, 4:8: 1 соответственно, итаблетируют при давлении, обеспечивающем распадаемость таблеток в воде при 40-50 С в течение 0,5-1,0 мин. чНасыщение питательнои средывоздухом 1 О и /ч в течение35 мин и перемешивание 200 об/1433981 Т а б л и ц а 2 Активность высушенной биомассы,ед/мг Соотношение объема ацетона к объему сырой биомассы 3,6 25 20 3,6 3,7 15 4,1 10 4,2 4,1 700 Вр Составитель И.ПриваловМ.Петрова Техред М.Ходанич орректор О.Кравцо Подписноео комитета СССРи открытийушская наб д. 4/5. Тираж 520 Государственноделам изобретений Москва, Ж, Р но-полиграфическое предприятие, г. ужгород, ул. Проектная,П од аказ 5517/28 ВН КИПИ по 113035