Способ получения глицеролкиназы

(19) (И) сю 4 С 1209 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Институт биохимии и физиологиимикроорганизмов АН СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИЦЕРОЛКИНАЗЫ (57) Изобретение относится к области биотехнологии. Цель изобретения - уп рощение процесса очистки и повышениевыхода целевого продукта. Способ предусматривает использование аффиннойхроматографии на агарозном сорбентес иммобилизованным красителем активным ярко-голубым КХ для выделения иочистки фермента. Гомогенат, полученный после дезинтеграции дрожжевойбиомассы, подвергают тепловой обработке (10 мин при 60 С), отделяюткоагулированный белок центрифугированием, хроматографируют на колонкес сефарозой 4 Б с пришитым красителемактивным ярко-голубым КХ. Фракции,содержащие глицеролкиназу, наносятна колонку с ДЭАЭ-сефарозой и элюируют с нее 0,5 М раствором ИаС 1. 3 ил.1 табл.Изобретение относится к биотехно- логии, а именно к способам получения ферментов, и может быть использовано в микробиологической, химической и медицинской промьппленности.Глицеролкиназа (К.Ф.2,7.30) может применяться в качестве основного компонента реакционной смеси, используемой для определения глицерина при 10 его производстве в химической промьппленности, при измерении потребления глицерина как субстрата в микробиологической промышленности. В медицине глицеролкинаэа используется для опре деления содержания триглицеридов в крови.Цель изобретения - упрощение процесса очистки и повышение выхода фер мента глицеролкиназы 20На фиг. 1 показана аффинная хроматография глицеролкиназы на иммобилизованном красителе активном ярко-голубом КХ (1 - концентрация белка, 2 , удельная активность глицеролкиназы); 25на фиг, 2 - влияние рН на стабильностьглицеролкиназы; на фиг. 3 - влияние рН на активность глицеролкиназы. Способ заключается в том, чтопосле тепловой обработки проводятаффинную хроматографию на сефарозе4 Б с иммобилизованным триазиновым ;красителем активным ярко-голубым КХ ,(ГОСТ 20447-75) . Краситель прочно , 35связывается с агарозной матрицей -с сефарозой, что обеспечивает возможность длительного использованиясорбента лиганда.Для выделения глицеролкиназы го могенат, полученный после дезинтеграции дрожжевой биомассы (выращенной в питательной среде с глицерином), подвергают тепловой обработке (10 мин при 60 С), отделяют коа" 45 гулированный белок центрифугированием, хроматографируют на колонке с сефарозой 4 Б с пришитым красителем активным ярко-голубым КХ. Фракции, содержащие активность глицеролкинаэы, наносят на колонку с ДЭАЭ-сефарозой и элюируют с нее 0,5 М раствором ХаС 1, Выход фермента составляет 68- 72% от содержания его в бесклеточном экстракте. 55В предлагаемом способе фермент непрочно связывается с красителем и после нанесения на сорбент вымывается исходным буфером (фиг.1). Такой подход дает возможность еще большеупростить процедуру очистки и получить фермент без добавок элюирующихвеществ, что позволяет наносить активные фракции на ионообменник длядальнейшей очистки без дополнительной обработки.П р и м е р 1, Дрожжи СапдЫа ча 1 дйа 7-622 выращивают в среде Ридерс глицерином (1 ) в колбах на качалке. После культивирования. (16 ч)клетки собирают центрифугированием(4000 я, 10 мин), промывают 0,05 Мфосфатным буфером (рН 6,0) и сновацентрифугируют. Промытые клетки суспендируют в 0,05 М фосфатном буфере(рН 6,0), содержащем 10 мМ МяС 110 мМ глицерина, 1 мМ ЭДТА (буфер А)в соотношении 10 мл буфера на 1 гдрожжей. Клетки разрушают путем продавливания на прессе из замороженного состояния. Неразрушенные клетки иклеточные стенки удаляют центрифугированием. Бесклеточный экстракт прогревают 10 мин при 60 С на водянойбане, коагулированный белок отделяютцентрифугированием (4000 я, 20 мин).Супернатант (5 мл) наносят на колонку (2,5 20 см), заполненную сефарозой 4 Б со связанным красителем активным ярко-голубым КХ и уравновешенную буфером А.Краситель связывается с сефарозойследующим образом. К 150 мл сефароэыдобавляют 2,5 ИаСОз в 50 мл дистиллированной воды и 50 мл 2 -ного раствора красителя, затем смесь инкубируют 40 ч при 45 С с перемешиванием,После инкубации гель переносят наворонку Бюхнера и отмывают сначаладистиллированной водой, затем 0,1 н,НС 1 (0,5 л), снова водой 0,1 н. МаОН(0,5 л) и водой до нейтральногорН (6). Полученным сорбентом заполняют колонку и уравновешивают буфером А,Элюцию фермента с красителем проводят исходным буфером и собираютфракции по 2 мл (фиг,1), Фракции,содержащие активность глицеролкиназы, объединяют и наносят на колонку(1,5 ф 20 см) с ДЭАЭ-сефарозой, уравновешенную буфером А. Фермент элюиру-.ют тем же буфером, содержащим 0,5 ММаС 1. Скорость элюции в обоих случаях 44 мл в час. Процедура очисткисуммирована в таблице, Выход фермента составляет 72 от содержания вСтадия очистки Общий белок, мг Удель- ная акОбщая активностьЕ Выход,ХтивностьЕ/мг белка Бесклеточныйэкстракт 100 0,2 54,3 10,9 88 12 9,6 0,8 Прогрев Аффинная хроматография 82 225 72 325 0,2 9 45 0,12 7,8 65 ДЭАЭ-сефароза П р и м е ч а н и е. Белок определяют по Лоури. 31433 грубом экстракте, удельная активность 65 Е/мг белка. При электрофорезе в ПААГ препарат глицеролкиназы дает одну минорную полосу. Фермент очищен в 325 раз. Активность глицеролкиназы5 определяют в сопряженной реакции с глицерол-фосфат-дегидрогеназой (7). К объединенным Фракциям, содержащим активность глицеролкиназы, добавляют для стабилизации фермента (МН) БО до концентрации 2 М и этиленгликоль (10% по объему). В таком виде суспензия фермента готова к употреблению и стабильна в течение года.Глицеролкиназа из СапйЫа ча 1 Ыа стабильна при рН 5,0-6,0 (фиг.2). Оптимальное значение рН для реакции фосфорилирования глицерина составляет 9,8 (фиг. 3)20В таблице дана процедура очистки глицеролкиназы из СапйЫа ча 1 Ыа,П р и м е р 2. В качестве источника глицеролкинаэы используют дрожжи СапйЫа 11 ро 1 игдса 695 (ВКМ У), Культивирование дрожжей и выделение глицеролкиназы проводят по примеру 1. Выход фермента составляет 683, удельная активность 35 Е/мг белка, степень очистки - 116 раз.П р и м е р 3. В качестве источника выделения глицеролкинаэы используют дрожжи БассЬагощусез сегечъпае 354, Культивирование дрожжей и выделение фермента проводят аналогично предыду щим примерам. Выход фермента состав 980ляет 703; удельная активность 50 Е/мг белка; степень очистки - 220 раэ.Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить процесс получения глицеролкиназы и повысить выход продукта в 1,9-2 раза по сравнению с известным способом за счет сокращения числа стадий очистки и применения метода аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованным красителем активным ярко-голубым КХ.Способ позволяет значительно сократить продолжительность процесса очистки фермента. Формула и э о б р е т е н и я Способ получения глицеролкиназы, предусматривающий культивирование дрожжей на питательной среде, содержащей минеральные соли и глицерин, получение бесклеточного экстракта с последующим выделением из него фермента с использованием тепловой обработки и хроматографии на слабоосновном анионите с полисахаридной основой в 0,05 М Фосфатном буфере с рН 6,0 и элюцией 0,5 М раствором хлористого натрия в том же буфере, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода продукта, после тепловой обработки проводят аффинную хроматографию на сефарозе 4 В с иммобилизованным триазиновым красителем активным ярко-голубым КХ./28 Тираа 520 Подписи ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/