Способ определения физиологического состояния бактериальных клеток еsснеriснiа coli в препарате

-13 Бюл. У 29й научно-исследтут особо чисты а- би ицкии, АО.В.Андр 88.8) а Т,В., ть культ Г.Сергеев,ева 1 О,А, чной уревич ры киш я, 197 робиолог т,45,ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ Д ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОКЕБСНЕК 1 СН 1 А СО 1.1 В ПРЕПАРАТЕ(57) Изобретение относится к областипрактической и экспериментальноймикробиологии. Целью изобретения является упрощение способа и сокращениевремени определения. Способ заключается в том, что дифференцируют бактериальные клетки в высушенном препарате ЕвсЬегдсЬда со 1 по их светооптическим характеристикам и по содержанию оптически плотных и структурированных клеток судят о жизнеспособности, а по содержайию оптически плотных клеток - об устойчивости кстрессовым воздействиям. 1 табл.,2 ил.30 1 132837Изобретение относится к практической и экспериментальной микробиологии, в частности к способу определения жизнеспособности и устойчивостибиопрепаратов к стрессовым воздейст 5виям,Цель изобретения - упрощение способа и сокращение времени определения,10Способ осуществляется путем микроскопирования в фазовом контрасте высушенных бактериальных клеток Е.со 11в препарате. Для этого на чистое покровное стекло наносят 2-5 мкл 0,010,05%-ного раствора тетрабората натрия, который, являясь эмульгатором,препятствует агрегированию клетокЗатем сюда же вносят 1-10 нл исследуемого биопрепарата и, тщательноперемешав, дают суспензии высохнутьКоличество материала выбирают такимобразом, чтобы пятно слегка опалесцировало, а на просвет было прозрачным, Полученный таким образом препарат укрепляют на предметном стеклес помощью смазки, следя за тЕм, чтобы пятно оставалось сухим, и микроскопируют указанным способом.В поле зрения микроскопа можнонаблюдать три типа клеток, которыехарактеризуются строго определенными морфологическими и связанными сними светооптическими характеристиками, Пользуются оптическими признаками, подразумевая взаимно однозначное соответствие морфологическимЦпризнакам клетки,Тип Ь. Оптически пустые клеткиокруглой Формы. Хорошо видна оболочка, но структурные элементы внутримикроорганизма отсутствуют,Тип С, Клетки с оптической структурой вытянутой (овальной) формы.Внутри хорошо различимой оболочки 45имеют место структурные элементынапример, полюса.Тип Б. Оптически плотные (темные) клетки вытянутой формы, Структурные элементы едва различимы. 50С помощью окулярной сетки определяют абсолютное, а затем и относительное содержание в препарате клеток с рассмотренными признаками.Ведение анализа сухих бактериальных препаратов позволяет сократитьвремя определения жизнеспособностидо 3-5 мин с погрешностью, не превышающей 2%, с одновременным определе 7 2нием устойчивости микробной популяции к стрессовым воздействиям.Использование предлагаемого способа позволяет дополнительно определить устойчивость микробной популя-, ции к стрессовым воздействиям и существенно (до 3-5 мин, или в 400 - 500 раз) уменьшить время анализа биопрепарата.П р и м е р 1. На покровное стек" ло наносят 2 мкл 0,05 ."ного раствора тетрабората натрия и сюда же.вносят 2 нл исследуемой культуры Е.со 1 с жизнеспособностью по данным биологического контроля 57%. Препарату дают высохнуть, укрепляют на предметном стекле и микроскопируют в фазовом контрасте с объективом 70 х и окуля ром 10 х. В препарате определяют от" носительное содержание клеток с определенными оптическими характеристиками: Ь-тип 43%, С-тип 40 , Б- тип 8 Жизнеспособность исследуемого биопрепарата: С + Б = 57 опреде ляется суммарным содержанием клеток С- и Б-типа.П р и м е р 2. Препарат готовят .и микроскопируют аналогично примеру 1, По данным биоконтроля высушенный образец характеризуется жизнеспособностью 14%. В поле зрения микроскопа определяют относительное содержание клеток с определенными оптическими характеристиками: Ь-тип 34%, С-тип 52 , Б-тип 14 ,. Устойчивость препара та к высушиванию 14 . определяется со. держанием клеток Б-типа.П р и м е р 3. Препарат лиофилизированной культуры готовят и микро" скопируют аналогично примеру 1По данным биологического контроля бактериальный препарат характеризуется жизнеспособностью 7%. Затраты времени, необходимого для проведения ана" лиза, около 28 ч. В поле зрения микроскопа определяют относительное содержание клеток с определенными оптическими признаками: Ь"тип 53%, С-тип 40 ., Б-тип 7%. Устойчивость препарата к высушиванию 7% определяется содержанием клеток Б-типа. Затраты времени 5-б мин,В табл,1 представлены результаты определения жизнеспособности и устой чивости к высушиванию различных бактериальных препаратов Е.со 1. Микрокультуральный метод показал, что относительное содержание клеток, обра77 4работ приблизительно в 300 раз (272 раза), Необходимо отметить, что предлагаемый способ позволяет исследовать на одном покровном стекле до 9-16 препаратов, следовательно,суммарная эффективность может быть повы" шена еще примерно вдвое, т,едоведена до уровня 400-500 раэ.Зависимость результатов микрокультурального метода определения жизнеспособности биопрепарата от содержа" ния клеток С- и Я-.типов представлена на фиг.1, Аналогичная зависимость для высушенных образцов и содержания клеток Я-типа представлена на фиг.2. Содержание в препарате клеток С- и Я-типов определяет жизнеспособность микробной популяции, а содержание клеток Я-типа - ее устойчивость к стрессовому воздействию. В таблице представлены результаты исследования различных биопрепаратов,1 з 13283зовавших колонии до высушивания препарата, составляет соответственно70 и 22 Х для штамма Е,со 1 Ми90 и 957 для штамма К,Определение относительного содер 5жания клеток С- и Я-типов показывает, что суммарное их количество 71,222 дпя Е.со 1 д Ми 91, 943 дляЕ.со 1 Ксоответствует значениямжизнеспособности, определенным микрокультуральным методом, С другой стороны, высушенные различными способа-.ми бактериальные препараты характеризуются пониженной жизнеспособностью,которая по данным биологическогоконтроля составляет 5 и 19 Х для Е,со 11 Ми 07 для штамма К. Морфологический анализ позволяет определить, что содержание клеток Я-типасоставляет соответственно 4,19 и ОХ,следовательно, присутствие клетокЯ-типа характеризует жизнеспособностьмикробной популяции после стресса,т.е. ее устойчивость к высушиванию. 2 бПриводим результаты хронометрирования предлагаемого способа посравнению с известным, Известный микрокультуральный метод при условииналичия необходимых веществ химической чистоты предусматривает следующие операции: приготовление питательной среды и нанесение ее тонкойпленкой на предметное стекло 2,5 ч,нанесение на питательную подложку35исследуемой культуры, подсушиваниеи герметизация покровным стеклом0,5 ч, 1-е микроскопирование препара"та 0,1 ч, инкубирование в течение16-24 ч при 21 С, 2-е микроскопирование с определением числа микроколоний 0,1 ч,Согласно предлагаемому способу проводят следующие операции: приготовлениераствора тетраборатанатрия 1 мин; при-, 4 бготовление препарата 2 мин;микроскопирование 3-8 мин, Общие затратывременисоставляют 6 мин. Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает повышение эффективности микробиологических Применение предлагаемого способа определения физиологического состояния бактериальных клеток позволяет по .сравнению существенно упростить анализ биопрепарата и уменьшить (в 400-500 раз) время определения жизнеспособности и устойчивости микробных клеток к стрессовым воздействиям. Формула изобретения Способ определения физиологического состояния бактериальных клеток ЕзсЬегсЫа со 1 в препарате путем микроскопирования, о т л и ч а ю - щ и й с я, тем, что, с целью упрощения способа и сокращения времени оп" ределения, в процессе микроскопиро" вания осуществляют дифференциацию микроорганизмов в препарате,по их светооптическим характеристикам и по содержанию оптически плотных и структурированных клеток оценивают их жизнеспособность, а по содержанию оптически плотных клеток - устойчи" вость к стрессовым воздействиям,1328377 опрепа Жис вия 1 )5 7 9 5 2 7 2 е Я.19 5 суш 2 2 90 9 Е.со 13. -К 4 б ЧО Б -МБульоннакультура10 нл Колониянатвердой питательной Конвехтивнаясушка 10 Бульоннкультур10 нл Колония натвердойпитательнойсреде нвективнасушенная10 ял контроль, езультаты анели1328377 Составитель Л.БорисоТехред А.Кравчук орректор И. Муск едактор С.Патрушева аз 3453/2 писное д.4/5 оизводственно-прлиграАическое предприятие, г,ужгород, ул.Прое ВНИИПИ Гос по делам 113035, Мо