Способ получения фосфолипидов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИК 09) И 1 БРЕТЕНИЯ АНИ ВУ Па яйстко,ФОЛИПИДОВ я к пищевои мышленности ио при получерья животного ФОС итс применяютсятвенных икормовых и ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦТИИ ВТОРСКОМУ СВИДЕТ(71) Институт биохимии им. Аладина и Украинская сельскохвенная академия(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ (57) Изобретение отно фармацевтической про может быть использова нии фосфолипидов из с происхождения, которы при производстве лека косметических средств 4 А 23 С 17/00 7/00 А 61 К 37/2 пищевых добавок, а также в качестве реагентов для научных исследований. Целью изобретения является увеличение выхода фосфолипидов. Для получения фосфолипидов перед экстракцией в пахту вводят минеральную или органическую кислоту с соотношением пахты и кислоты (1:0,001 - 1:0,0023). Экстракцию липидов из осадка проводят смесью хлороформа и метанола в соотношении (1:1,5)-(1:2) двукратноо на холоду (0-4 С) с последующим выделением фосфолипидов из экстракта при соотношении экстракта и ацетона (1:2)-(1:3) или колоночной хроматографией на окиси алюминия смесью Я хлороформа и метанола в соотношении. (3:1)-(3:1,5), а в качестве минеральной или органической кислоты используют 35-36%-ную соляную или 98- ООХ-ную уксусную кислоту. 6 табл.1289440 1Изобретение относится к пищевойи химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано приполучении Фосфолипидов иэ сырья животного происхождения, которые применяются при производстве лекарственных и косметических средств, кормовых и пищевых добавок, а также вкачестве реагентов для научных исследований,Цель изобретения - увеличениевыхода фосфолипидов.Способ заключается в том, что вкачестве сырья животного происхождения используют пахту, в которую перед экстракцией вводят минеральнуюили органическую кислоту с соотношением пахты и кислоты (1:0,001) -.(1:0,0023), Экстракцию липидов изосадка проводят смесью хлороформаи метанола в соотношении (1:1,5)(1:2), а выделение фосфолипидов изэкстракта ведут при соотношении экстракта и ацетона (1:2) -(1:3) или колоночной хроматографией на окиси алюминия смесью хлороформа и метанола всоотношении (3:1)-(3:1,5), при этомв качестве минеральной или органической кислоты используют 35-36 .-нуюсоляную или 98-100 .-ную уксуснуюкислоты.Обработка пахты кислотой в соотношении пахты и кислоты (1:0,001)(1-0,0023), обеспечивает коагуляциюмембран жировых глотул пахты, которые затем отделяют от водной фазы,из осадка экстрагируют липиды и изэкстракта осаждают фосфолипиды спомощью подобранных органическихрастворителей при определенных соотношениях. Использование нового сырьевого источника при оптимальныхусловиях выделения фосфолипидов обеспечивает выход фосфолипидов до 9095 при одновременном снижении себестоимости конечного продукта.В качестве коагулянтов могут бытьиспользованы минеральные или органические кислоты. Наиболее доступными из них являются соляная и уксусная. Благодаря коагулированиюмембран жировых глобул увеличивается выход сухой массы пахты в 7890 раз, что позволяет значительноускорить и упростить режим ее отделения.В результате многочисленных экспериментов бьшиопределены оптимальные количества применяемых реагентов. 2Использование кислоты в качествекоагулянта в соотношениях меньших1:0,001 вызывает неполную коагуляцию.При соотношениях выше 1:0,0023 наблю 5 дается окисление липидов (исследования проводили методом микротонкослойной хроматографии), что ухудшаеткачество продукта и имеет место необоснованный перерасход коагулянтов.10 Экстракцию липидов мембран жировых глобул пахты осуществляют смесьюхлороформ:метанол в соотношении(1:1,5)-(1:2) двукратно на холоду(0-4 С) с последующим отделениемэкстрагированных липидов от белков,центрифугированием при 1000 об/минв течение 5 мин, концентрированиемлипидов, упариванием растворителейна роторном испарителе.Как видно иэ табл. 3, оптимальным соотношением смеси хлороформ:метанол является соотношение 1:(1,5-2),обеспечивающее максимальный выходконечной фракции. Конечную фракциюфосфолипидов выделяют из экстрактапутем осаждения ацетоном при объемном соотношении экстракт - ацетон1:(2-3),Как видно из табл. 4, при осаждении фосфолипидов ацетоном в соотношении экстракт:ацетон меньшимчем 1:2 выход конечного продуктаснижается вследствие неполного осаждения, а при большем количестве аце 35тона при соотношении 1:(4-6) частьФосфолипидов переходит в ацетоновыйраствор. Выход фосфолипидов составляет при соотношении экстракт:ацетон 1:(2-3) 60-65,7 , при соотношении 1:(0,8-1), 50-51 , при соотношении 1:(4-6)33,37 .Колоночная хроматография позволяет выделить фосфолипиды практически45 в чистом виде, однако использованиехроматографических методов сопровождается потерями вещества. При выделении фосфолипидов путемколоночной хроматографии достигается 5 О выход фосфатидилхолина (лецитина)89-91П р и м е р 1, К 1 л пахты добавляют 35 .-ную НС в соотношении пахта:кислота 1:0,0023 (до появления 55 признаков коагуляции). Затем выделяют осадок центрифугированием на рефрижераторной низкооборотной центрифуге при 1000 об/мин в течение 5 мин,опри 4 С. Супернатант удаляют, а к1289440 Таблица 1Сравнительный выход основных классовлипидов (г/1 л) Пахта цельная, не обработаннаякислотой Классы липидов Пахта после обработки кислотой 98-1003-наяСН СООН 35-36 Ж-наяНС 1 Общие липиды 15-20 24-26 16,8-19,6 5,2-6,0 0,1-0,30,07-0,.8 9,7-13,0 3,0-4,0 Глицериды Фосфолипиды 0,025-0,04 0,004-0,009 1,2-3,0 Стерины стериды 0,75-1,0 осадку добавляют 2,1 л смеси хлороформ - метанол в соотношении 1:1,5овыдерживают на холоду при 0 С в течение 2 ч при периодическом помешивании, снова центрифугируют в прежнем режиме. Первый экстракт сливают,а осадок вновь обрабатывают 2,1 лсмеси хлороформ - метанол в соотношении 1:1,5 в течение 3 ч,Осадок удаляют центрифугированием 0в аналогичном режиме, а экстрактыобъединяют, добавляют 2 л дистиллированной воды. После разделения фазверхнюю водно-метанольную фазу декантируют, а нижнюю (хлороформный 5экстракт липидов) упаривают на роторном испарителе при пониженном давлении до объема 7.мл, К полученномуконцентрированному экстракту добавляют холодный ацетон при 4 С в соотношении экстракт - ацетон 1:3, выдерживают на холоду при 4 С в течеоние 2 ч, осадок фосфолипидов отфильтровывают .и растворяют в хлороформе.Выход общих липидов составляет7,3 г/л, а фосфолипидов - 4,7 г/лили 647.Результаты получения фосфолипидовпо примерам 2-7 представлены в табл.6.ЗО Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить высокий выход комплекса фосфолипидов 57-657 из легко доступного и дешевого природного сырья - пахты - неосновного продукта масляного производства. Получаемые фосфолипиды могут найти применение как в медицине, ветеринарии, так ив фармацевтической, парфюмерной ипищевой промышленности.Снижение себестоимости конечного продукта, получаемого согласно предлагаемому способу относительно комплекса фосфолипидов, получаемых изяичных желтков, объясняется низкойстоимостью пахты,Формула изобретения Способ получения фосфолипидов,предусматривающий экстракцию липидовиз сырья животного происхождения органическим растворителем, выделениефосфолипидов из , экстракта, добавлением ацетона к последнему, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью увеличения выхода фосфолипидов,в качестве сырья животного происхождения используют пахту, в которуюперед экстракцией вводят минеральную или органическую кислоту в соотношении пахта:кислота 1:0,001 -1:0,0023, экстракцию липидов изосадка проводят смесью хлороформ:метанол в соотношении 1:1,5-1:2, а выделение фосфолипидов из экстрактаведут при соотношении экстракт:ацетон 1:2-1:3 или колоночной хроматографией на окиси алюминия смесьюхлороформ:метанол в соотношении3:1-3:1,5, при этом в качестве минеральной или органической кислотыиспользуют 35-367-ную соляную или98-1003-ную уксусную кислоту,289440 Таблица 2 Зависимость выхода сухой массы и липидов пахты от условий коагулированияВыходсухоймассы Соотношение пахта::кислота Выход Коагулянты липиФ дов, г/л пахты,г/л 35%-наяНС 98%-ная Таблица 3 Зависимость выхода липидов от условий экстракцииСоотношения хлороформ:метанол Классы липидов, г/л т1:0 1:1 1:1,5 1:2 1;3. Общие липиды 18 21 Глицериды 13,5 13,7Фосфолипиды 3,0 3,9 1 Таблица 4 Зависимость выхода липидов от условий осаждения ацетономСоотношение экстракт:ацетон в основном липидном составе Компоненты 1: ,018-1) 1: (2-3) 1; (4-6) г/л % г/л % г/л% 3,5-5,0 1,5-2,0 51-53 70-7, 6 21 -22 2,6-3,0 26-26,5 4,2-4,6 49-50 4,5-5,6 55-57 18-19 1,8-2,5 23-26 30-31 1,8-2,5 19-20 1,5-2, 1 О, 1-0,2 3-0,5 О, 1-0,5 0,6 Общие липиды Глицериды фосфолипиды Стерины, сте- риды 1:0,00091:0,0011:0,0021:0,003 1:0,00091:0,0011:0,00231:0,003 20 9 4524 47 26 47 26 8 7 35 15 40 20 20 20 24 26 20 16,8 19,6 15,1 5,2 6,0 4,07 1289440 8Таблица 5Химический состав липидов пахты в сравнениис составом липидов яичного желтка (по прототипу) Основной липидный состав Компоненты после согласпосле после но прототипу экстракции Глицериды 40-60 31-42 3-5 65-70 Стерины, стериды Э2-3 3-5 35-57 55-65 95-97 Фосфолипиды 23-25 Таблица 6 йПример2 3 4 5 6 .7 Показатель Вид и концентрация коагу-.лянта 363-ная 353-наяНС 1 НС 1 003-ная уксусная 363-наяНС 1 353-наяНС 1 983-наяуксусная Соотношениепахта:кислота 1:0,0023 1:0,001 1:0,0018 Отделениеосадка Центрифу- Фильтро- Центрифу- Фильтрогирование ванне гирование ванне 1:2 1:2 1 ф 2 1:1,5 1:2 1:1,5 Осаждение Осажде- Осаждение Осаждеацетоном ние аце- ацетоном ние ацетоном тоном Выделениефосфолипидов 13 1:Э 1:2 1:2 хроматографии 3:1 3:1,5 Выход фосфолипидов, Ж 65 55 63 91 88 57 Соотношениехлороформ -метанол приэкстракции Соотношение. экстракт -ацетон Соотношениехлороформ:метанол приколоночной осаждения ацетоном колоночной хроматографии Фильтро- Центрифувание гирование Колоноч- Колоночная хро- ная хро" матогра- матогра" фия фия