Способ получения бактериального концентрата мезофильных молочно-кислых стрептококков

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(54) (57) . СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАТА МЕЗОФИЛЬНЫХ МОЛОЧНО-КИСЛЫХ СТРЕПТОКОККОВ, предусматривающий приготовление питательной среды на основе молочной сыворотки с добавлением аминокислотно.микроэлементно-витаминного комплексааммивита в количестве 0,5 - 0,8%, буферныхсолей, микроэлементов, внесение закваски,культивирование с регулированием рН, выделение биомассы клеток из культуральнойжидкости и смешивание ее с защитной средой, содержащей фитин, отличающийся тем,что, с целью повышения содержания бактери,801242097 А 1 15 ц 4 А 23 С 9 12, С 12 М 1 20 альных клеток мезофильных молочно-кислых стрептококков в концентрате и увеличения стойкости его при хранении, на стадии культивирования в питательную среду вносят 1% обезжиренного молока, 0,3% гидролизата казеина и 0,00015% пепсина, а в защитную среду дополнительно вводят сахарозу, лимонно-кислый натрий и крахмал, при этом соотношение биомассы выделенных кле. ток и защитной среды устанавливают соответственно равным 1:2 - 1:4, при котором содержание сахарозы, лимонно-кислого натрия, крахмала и фитина в полученной суспензии составляет 1,33 - 1,6; 3,33 4; 1,0 - 1,2 и 0,13 - 0,16% соответственно.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после смешивания биомассы выделенных клеток с защитной средой проводят замораживание с последующей сушкой при температуре - 35 С в начале процесса и +30 С в конце процесса.3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сахарозу, лимонно-кислый натрий, крахмал, фитин вводят в защитную среду в количествве 2, 5; 1,5; и 0,2% соответственно.Изобретение относится к технической микробиологии, а именно к получению бактериального концентрата, используемого для приготовления производственной закваски, минуя лабораторную, и для непосредственного приготовления продукта - творога, сметаны, простокваши обыкновенной.Целью изобретения является повышение содержания бактериальных клеток мезофильных молочно-кислых стрептококков в концентрате и увеличение стойкости его при хранении.На фиг. 1 дана зависимость клеток мезофильных молочно-кислых стрептококков после замораживания и высушивания в зависимости от различного содержания сахарозы в суспецзии; ца фиг. 2 - то же, при содержании в суспензии 1,6 Я сахарозы и различном содержании лимонно-кислого натрия; на фиг. 3 - то же, при содержании в суспензии 1,6 Я сахарозы, 4 Я лимонно- кислого натрия и различном содержании крахмала; на фиг. 4 - то же, при содержании в суспензии 1,6 Я сахарозы, 4 Я лимонно-кислого натрия, 12 О" крахмала и различном содержании фитина.Способ предусматривает приготовление питательной среды на основе молочной сыворотки с добавлением аминокислотно-микроэлементно-витаминного комплекса - аммивита в количестве 0,5 - 0,8 Я буферных солей, микроэлементов, внесением закваски, культивирование с регулированием рН, выделение биомассы клеток из культуральной жидкости и смешивание ее с защитной средой, содержагцей фитин. На стадии культивирования в питательную среду вносяхЯ обезжиренного молока, О,ЗО/ гидролизата казеина и 0,00015 пепсина. В защитную среду дополнительно вводят сахарозу, лимонно-кис. лый натрий и крахмал. Соотношение биомассы вь 1 деленных клеток и защитной среды устанавливают соответственно равными от 1:2 до 14.При этом содержание сахарозы, лимонно- кислого натрия, крахмала и фитина в полученной сусцензии составляет 1,33 - 16; 3,33 4; 1,0 в 1,2; 0,13 в 1,16 О соответственно.Предпочтительно при осуществлении способа после смешивания биомассы выделенных клеток с защитной средой проводить замораживание с последующей сушкой при температуре - 35 С вначале процесса и 30 С в конце процесса.Целесообразно сахарозу, лимоцно-кислый натрий, крахмал и фитин вводить в защитную среду соответственно в количествах 2,5; 1,5 и 0 2 оМаксимальное увеличение роста клеток на 12 - 25 Я наблюдалось при внесении аммивита в количестве 0,5 - 0,8 О, от массы среды.При внесении аммивита в количестве 0,8 - -1,5 Я от массы среды дальнейшего увеличения роста клеток не происходит. Амми 5 1 О 5 20 25 3 З 5 40 4 с 50 55 вит имеет очень низкое рН и при его внесении значительно снижается рН среды культивирования.Кислотный гидролизат казеина содержит не только аминокислоты, но также пептиды и другие фракции белка, которые необходимы для роста микроорганизмов. Опытным путем установлено, что оптимальным является добавление в среду в процессе культивирования О,ЗЯ гидролизата казеина. Большее количество гидролизата казеина тормозит рост мезофильных молочно-кислых стрептококков, а меньшее дает увеличение количества клеток всего на 10 в 15 Я .Пепсин является протеолитическим ферментом животного происхождения, который проводит гидролиз белков молока до аминокислот, которые хорошо усваиваются мезофильными молочцо-кислыми стрептококками и стимулируют их рост.Введение в среду пепсина является целесообразным лишь в сочетании со стерильным обезжиренным молоком. Оптимальным является введение в среду 0,00015 Я пепсица и 1 Я обезжиренного молока. Среда обогащается серосодержащи ми дика рбоновыми ароматическими аминокислотами.Содержание незаменимых аминокислот значительно увеличивается - лизина в 2,5 ра за, метионица в 1,7 раза, валина в 1,2 раза,фенилаланина в 5,2 раза.При внесении 1,5 Я обезжиренного молока количество незамецимых аминокислот увеличивается и количество клеток увеличивается на 18- - 20 Я.При внесении 0,6 - 0,8 Я обезжиренного молока количество клеток увеличивается всего на 9 - 12 Я. Внесение большего количества пепсина не дает заметного увеличения содержанию аминокислот, а снижение его количества приводит к недостаточному гидролизу белков молока, что отрицательно влияет на рост клеток.При соотношении биомассы и защитной среды 1:4 содержание сахарозы в защитной среде составляет 2 Я, лимонно-кислого натрия 5/, крахмала 1,5 Я, фитина 0,2 Я.При соотношении биомассы и защитной среды 1:2 на 12 кг биомассы берут 24 кг защитной среды и полученная суспензия в количестве 36 кг содержит 1,33 Я сахарозы, З,ЗЗЯ, лимонно-кислого натрия, Я крахмала и 0,13 фитина.Защитные среды устраняют вредное действие кислорода, не дают пересыхать бакконцентрату, регулируют осмотическое давление. как внутри клетки, так и вне ее.Устойчивость клеток к замораживанию и высушивацию в значительной степени зависит от природы и концентрации криозащитных веществ, содержащихся в защитных средах.При исследовании выживаемости мезофильных молочно-кислых стрептококков в защитной среде, содержащей различцые коли1242097 1 О 15 20 30 чества сахарозы, лимонно-кислого натрия, крахмала, фитина, установлено, что эвтектическая зона суспензии клеток (смесь биомассы с защитной средой) находится в пределах от - 25 до - 35 С. При этом в суспензии клеток содержится сахарозы 1,33 - 1,6%, лимонно-кислого натрия 3,33 - 4%, крахмала 1 - 1,2%, фитина 0,13 - О, 6%.Согласно фиг. 1 - 4 самая высокая выживаемость клеток при замораживании и высушивании наблюдается при содержании в суспензии клеток указанного количества ком -понентов.Увеличение содержания компонентов в защитной среде приводит к снижению эвтектической зоны до температуры от - 40 С до - 45 С, продолжительность сушки увеличивается, количество клеток остается на прежнем уровне, Опытным путем было установлено, что при температуре - 35 С в начале сушки и при досушивании при +30 С отмечалась лучшая сохраняемость клеток в суспензии клеток (89 - 95%).Снижение температуры в начале процесса сушки значительно увеличивает продолжительность сушки, а повышение температуры досушивания (до 35 - 40 С) приводит к большой гибели клеток (82 - 85%).Пример 1. Для приготовления сухого бактериального концентрата мезофильных молочно-кислых стрептококков берут 260 л сыворотки из-под творога с рН 4,5, добавляют 5 л аминокислотно-микроэлементновитаминного комплекса и все нагревают в ванне ВДП до 93 С и выдерживают при этой температуре 60 мин.Для приготовления 1000 л среды сыворотку с аминокислотно-микроэлементно-витаминным комплексом смешивают в ферменторе с 650 л питьевой воды и добавляют 10 кг лимонно-кислого натрия и 165 г сернокислого марганца. Устанавливают реакцию среды 25%-ным водным раствором аммиака до рН 6,5.40После этого проводят стерилизацию при 118 С (давление 0,08 МПа) и выдерживают при этой температуре 60 мин, а затем охлаждают до 30 С. В подготовленную среду вносят 30 л закваски, приготовленной на стерилизованном обезжиренном молоке. 45Через 3 ч культивирования в ферментер вносят 1 О л стерилизованного обезжиренного молока, 1,5 г пепсина (предварительно растворенного в 100 мл стерильного физиологического раствора) и 3 л стерилизованного гидролизата казеина.Выращивание мезофильных молочно-кислых стрептококков проводят в течение 10 ч в условиях периодического культивирования, поддерживая рН на уровне 6,5 путем постоянной нейтрализации среды 25%-ным раствором аммиака.После окончания процесса культивирования культуральную жидкость охлаждают до 10 С и направляют на бактофугирование.Из 1000 л среды получают 12 кг биомассы. В биомассе определяют количество клеток, Для этого берут две пробирки с 10 мл стерильной воды, подогретой до 30 С. В одну пробирку отвешивают 1 г биомассы, хорошо ее перемешивают с водой, так чтобы не было комочков. В другую пробирку наливают 1 мл рабочего раствора резазурина. Содержание двух пробирок соединяют в одну пробирку, закрывают резиновой пробкой, смешивают путем медленного трехкратного переворачивания пробирки. Пробирку помещают в водяную баню при ЗОС. Обесцвечивание резазурина произошло за 1 мин. Поэтому биомассу смешивают с защитной средой в отношении 1:4. Защитной среды берут 48 кг. Защитная среда состоит из 4900 мл 20%-ного раствора сахарозы, стерилизованной при 112 С в течение 30 мин, 6000 мл 40%-ного раствора лимонно-кислого натрия, стериллизованного при 121 С в течение 15 мин, 13091 мл 5,5%-ного раствора крахмала, стерилизованного при 135 С в течение 2 ч и 24009 мл воды с внесенными в волу 96 г фитина, стерилизованного при 135 С в течение 2,5 ч. Затем все составные части в асептических условиях сливают и получают 48000 мл защитной среды. Затем 12 кг биомассы смешивают в асептических условиях на системе с 48000 мл защитной среды.Полученную смесь разливают во флаконы по 7 мл. Затем флаконы помещают на лотки и замораживают при температуре - 50 С в течение 5 ч и супат сублимационным методом при следующих режимах: начальная температура сушки - 35 С, конечная температура досушивания +30 С, температура конденсатора минусовая, остаточное давление 1,1 Па, продолжительность сушки 36 ч.Флаконы закрывают стерильными полиэтиленовыми пробками и закрывают алюминиевыми колпачками. Получают 6,5 тыс, порций сухого бактериального концентрата. В 1 г (порции) сухого бактериального концентрата содержится 350 млрд. клеток.Пример 2. Для приготовления сухого бактериального концентрата мезофильных молочно-кислых стрептококков берут 260 л сыворотки из-под творога с рН 4,6, добавляют 5 л аминокислотно-микроэлементно-витаминного комплекса и все нагревают в ванне ВДП до 97 С и выдерживают при этой температуре 70 мин.Затем сыворотку освобождают от белков сепарированием. Для приготовления 1000 л среды в ферментере смешивают 250 л осветленной сыворотки с аминокислотно-микроэлементно-витаминным комплексом с 650 л питьевой воды и добавляют 10 кг лимонно- кислого натрия и 165 г сернокислого марганца. Устанавливают реакцию среды1 а 5 гряпнои ликонницслогп юг щг. Р 25 О-ным водным раствором аммиака дорН 6,8.После этого проводят стерилизацию среды при18 С (давление 0,08 МПа), и выдерживают при этой температуре 65 мин, азатем охлаждают до 30 С,В подготовленную среду вносят 50 лзакваски мезофильных молочно-кислых стрептококков, приготовленной на стерилизованном обезжиренном молоке.ОЧерез 4 ц культивирования в ферментервносят 10 л стерильного обезжиренногомолока, 1,5 г пепсина (предварительно растворенного в 100 мл стерильного физиологического раствора) и 3 л стерильного гидролизата казеина. 5Выращивание мезофильных молочно-кислых стрептококков проводят в течение 12 чв условиях периодического культивирования, поддерживая рН среды на уровне 6,8 путем постоянной нейтрализации среды 25 О 4 ным раствором аммиака. 20После оконцапия процесса культивирования культуральную жидкость охлаждают до8 С и нпранляют на бактофугирование.Из 1000 л среды полуцают 10 кг биомассы.Осветлень резазуриа проходит за 3 мин.Поэтому бкконцентрат смешивают с защитной средой в соотношении 1:2, т.е. защитной среды 20000 мл.Защитная среда состоит из 2000 мл 20%ного раствора сахарозы, предварительностерилизованной при 0,05 МПа, цто соответствует 14"С в течение 25 мин; 2500 мл40%-ного раствора лимонно-кислого натрия,предварительно стерилизованного при 122 Св течение 12 мин; 5454,5 мл 5,5 о-ногораствора крахмала, предваритепьно стЕрилизованного при 138 С в течение 2,5 ч и40 г фитина, помещенного в 10045,5 мл дистиллированной воды и все стерилизуют при 138 С в течение 2,3 ц. Затем все составные цасти в асептических условиях сливают и полуцают 20000 мл загцитной среды. Затем 10 кг биомассы смешивают в асептицеских условиях на смесителе с 20000 мл защитной среды.Пслуценную смесь разливают во флаконы по 6 мл. Затем флаконы помещают на лотки и за мора живают при температуре - 50 С в течение 6 ч и сушат сублимационным способом при следующих режимах: начальная температура сушки - 35 С, конецная температура досушивания +30 С, температура конденсатора - 60 С, остаточное давление 0,45 Па, продолжительность сушки 28 ч.Затем флаконы закрывают полиэтиленовыми пробками я закатывают алюминиевыми колпачками. Получают 4,5 тыс. порций сухого бактериального концентрата, в 1 г (порции) сухого бактериального концентрата содержится 300 млрд. клеток.Порция концентрата в 1 г (после ее предварительной активизации) свертывает 2000 л молока, подготовленного для выработки творога за 6 - 8 ц или 2000 л сливок при сквашивании за 12 - 14 ц.Сухой бакконцентрат сохраняет свою активность в течение 4 мес. и в сравнении с жидким имеет более высокую стойкость и высокую активность, цто позволяет его использовать непосредственно при приготовлении продукта. Таким образом, изобретение обеспечивает повышение содержания бактериальных клеток мезофильных молочно-кислых стрептококков в концентрате и увеличение стойкости его при хранении.1242097 вйржание аджипЮеС Составитель ЛТехред И. ВересТираж 543арственного комизобретений и оЖ - 35, Раушскат, г. Ужгород,Редактор Г. ВолковаЗаказ 3633/5ВНИИПИ Госудпо делам113035, Москва,Филиал ППП Патен 4/5 ая, урИ ъ Я ю Ц 50 ря