Способ получения иммобилизованной амилазы

1 п 1 586182 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(61) Дополнительное к авт. свид(22) Заявлено 30,08,74 (21) 205624с присоединением заявки ЛЬ(45) Дата опубликования описания 076 7/02 3/23 Государственный комитет Совета Министров СССР по делам изобретенийи открытий 53) 77.15.07088.8) ень М 4(71) Заявител ЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ а-АМ ИЛ АЗЫ(54) СПОС 10 Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментов, которые могут найти применение в химическом и фармацевтическом производстве, а также в пищевой промышленности.В числе ферментов, представляющих особый интерес для получения в иммобилизованном состоянии, следует назвать а-амилазу, которая находит широкое применение в пищевой промышленности для гидролиза крахмала до сахаров.К настоящему времени известен целый ряд препаратов иммобилизованной а-амилазы, полученных как ковалентным связыванием фермента с полимерным носителем, например модифицированной целлюлозой, так и включением в полиакриламидный гель.В частности, известен способ ковалентного связывания а-амилазы с эфирами целлюлозы. В этом случае иммобилизацию фермента проводят на предварительно обработанном для введения реакционноспособных групп носителе, например, диазосочетанием фермента с диазотированными 3- (п-аминофенокси) -2- оксипропиловым и 2-окси- (и-изотиоцианатофенокси) -пропиловым эфирами целлюлозы, Для иммобилизации раствор фермента в водном буфере при соответствующем значении рН перемешивают с нерастворимым носителем, причем иммобилизацию ведут при пониженных температурах в течение длительноговремени, получая в результате препарат иммобилизованного фермента, обладающий в зависимости от условий процесса различным со 5 держанием активного фермента, не превышающим, однако, во всех случаях 15 мг активного фермента на 1 г полимерного носителя.Однако такой способ, как и другие, известные к настоящему времени и имеющие лишьнезначительные отличия, имеет ряд недостатков, к которым относятся: сложность получения активированных полимерных носителей,использование токсичных препаратов, низкаяконтролируемость процесса иммобилизации,5 малая технологичность получаемых продуктов(а в случае включения фермента в гель - заметное вымывание активного фермента в процессе работы), а также невысокое качествополучаемых препаратов, определяемое коли 0 чеством связанного активного фермента наедипицу веса носителя.Термическая стойкость получаемых продуктов невысока - при выдерживании в течение 7дней при 45 С они сохраняют лишь 20 оо ис 5 ходной активности,Целью изобретения является упрощениепроцесса иммобилизации фермента а-амилазы, а также повышение качества продукта.Это достигается за счет того, что а-амила 0 зу вводят в водную или спиртовую среду вместе с карбодиимидом, а в качестве полимерного носителя используют карбоксилсодержащий материал.Предлагаемый способ заключается в том,что а-амилазу вводят в водную или спиртовую среду вместе с сочетающим агентом -карбодиимидом, используя в качестве носителя карбоксилсодержащий материал, напримерполипропиленовую ткань с привитыми группами акриловой кислоты, частично гидролизованный полиэтилентерефталат и т. д в форме тканей, пленок, гранул, волокон и т, и.При этом в случае проведения иммобилизации в водной среде прп значениях рН порядка 5 в соответствующем буфере, когдафермент полностью растворим, в качестве сочетающего агента применяют водорастворимые карбодиимиды, например 1-циклогексил 3- (2-морфолиноэтил) - карбодиимид-л-г-толуолсульфонат и т. д,Учитывая, что водорастворимые карбодиимиды представляют собой дорогие и дефицитные реактивы и сложны в производстве,предлагаемый способ предусматривает возможность проведения иммооилизации а-амилазы в этиловом спирте с использованием в-качестве сочетающих агентов значительно более дешевых и менее дефицитных карбодиимидов, растворимых в органических растворителях, например дициклогексилкарбодиимида. При этом к-амилаза образует в спирте не раствор, как в воде, а суспензпю, и таким образом иммобилизация протекает в гетерогенных условиях.Схему иммобилизации можно представитьследующим образом: фермент образует в спирте суспензию, очень небольшая часть фермента переходит в раствор, где взаимодействует с носителем через сочетающий агент, вызывая таким образом переход в раствор ещеодной порции фермента, ее иммобилизациюи т. д,Таким образом, настоящий способ предусматривает возможность иммобилизациифермента как из гомогенного раствора в воде, так и из суспензии в органическом растворителе - спирте. При этом количество иммобилизуемого фермента легко удается регулировать изменением его концентрации висходной смеси, изменением концентрации сочетающего агента и изменением времени реакции.Применяемые в способе в качестве исходных веществ соединения являются продажными препаратами или могут быть получены известными способами.Пр и м ер 1. 1 г а-амилазы (препарат Лмилоризин-П 10 х производства рассказовскогохимзавода с амилолитической активностью2000 ед/г) растворяют в 100 мл ацетатногобуфера с рН 5,0 и ионной силой 0,02. Растворохлаждают до 4 С, помещают в него образец полипропиленовой ткани с 12 вес. % привитой акриловой кислоты размером 4(4 сми при перемешивании добавляют различные 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 количества растворенного в том же буфере водорастворимого карбодиимида с мол. весом 492. Реакцию сочетания ведут в течение 2 - 48 ч, Затем ткань извлекают, промывают 500 мл того же ацетатного буфера, 250 мл 1 М КаС 1, 250 мл 0,001 н. НС 1 и 500 мл воды, все промывки ведут порциями по 50 мл и вы.сушивают. Амилолитическую активность препарата иммобилизованной а-амилазы определяют фотокалориметрически по количеству расщепленного крахмала.Количество активной иммобилизованной а-амилазы в мг/г носителя в зависимости от концентрации карбодиимида и времени реакции приведено в табл. 1. Количество активной иммобилизованной а-амилазы, мг/г, приконцентрации карбодиимида мг Пр и мер 2. 1 г сс-амилазы суспендируют в 100 мл 9 б% -ного этилового спирта, суспензию охлаждают до 4 С, помещают в нее такой же образец носителя, как в примере 1, и при перемешивании добавляют различные количества растворенного в спирте дициклогексилкарбодиимида. Бремя реакции и промывка ткани после иммобилизации такие же, как и в примере 1,1(оличество активной иммобилизованной а-амилазы, мг/г носителя, в зависимости от концентрации карбодиимида и времени реакции приведено в табл. 2. Количество активной иммобилизованной а-амилазы, мг/г, приконцентрации карбодиимида, мг Пр им ер 3. Суспензию а-амилазы готовят по примеру 2 и помеща;от в нее образец полиэтилентерефталатной пленки 4 К 4 см, предварительно подвергнутый гидролизу 3 н. НС 1 при 80 С в течение 48 ч, Все дальнейшие процедуры проводят, как в примере 2.586182 Таблица 3 Формула изобретения Количество активной иммобилизованной а-амилазы мг/г, при концентрации карбодиимида, мгСоставитель А. Богаров Техред И. Карандашова Редактор Т, Никольская Корректор О. Тюрина Заказ 3173,4 Изд. К 109 Тираж 563 НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное Типография, пр. Сапунова, 2 Количество активной иммобилизованной аамилазы в мг/г носителя в зависимости от концентрации карбодиимида и времени реакции приведено в табл. 3. Во всех трех случаях для каждого образца было проведено по 120 испытаний его активности, которая оказывалась постоянной, к тобму же все образцы сохраняли до 80 о, активности после выдерживания в течение 7 дней при 40 С. 1. Способ получения иммобилизованной10 а-амилазы на полимерном носителе, отлич а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощенияпроцесса иммобилизации и повышения качества продукта, а-амилазу вводят в водную илиспиртовую среду вместе с карбодиимидом, а15 в качестве полимерного носителя используют карбоксилсодержащий материал,2. Способ по п. 1, отличающийся тем,что в водной среде применяют водорастворимый карбодиимид.20 3. Способ по п. 1, отличающийся тем,что в спиртовой среде применяют карбодиимид, растворимый в органических растворителях,