Способ получения тимоцитарного антигена

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕО 94 ХРЕСПУБЛИН942 А 61 К 39/00 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ исходного сырья, ченной суспензии онной среде с посл гированием, диали жидкости и лиофил продукта, о т л и тем, что, с целью целевого продукта упрозением способ ного сырья исполь зию клеток выдерж кой среде при 44, 58-65 мин, диализ тиллированной воды проводят непосред лиза. ыдерж леток едующ ом нед зацие ч а ю повьаа юл. 9 24ва и Ю.М. Божокучно-исследовательдокринологии и обме-,Б о(56) и се лимф 1980 ер и др. свойства - Иммуно Выделение -антигена огня, Р 4 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ 2984863/28- 24.07.80 30.06.84Р,Г.Лукаш Киевский на институт энецествй 576.8.097 1. М.С. Бляологическиецитов мышей с. 22-26.(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИМОПИТА НОГО АНТИГЕНА путем гомогенизации ивания полув инкубациими центрифуостаточнойй целевогощ и й с яения чистоты с одновременнымв качестве исходуют тимус, суспенвают в изотоничес- -45 С в течениеоведут против диси лиофилиэацию твенно после диаИзобретение относится к биологии и медицине. Оно может быть применено для получения антигена тимоцитов, используемого в экспериментальной и клинической биологии и медицине для получения антитимоцитарных сывороток.Известен способ получения тимоцитарного антигена путем гомогенизации исходного сырья, выдерживания полученной суспенэии клеток в инкубационной среде с последующими центри фугированием, диалиэом надосадочной жидкости и лиофилизацией целевого продукта (1. Однако известный способ трудоемок и не обеспечивает высокой чистоты целевого продукта. 15Белью изобретения является повышение чистоты целевого продукта с одновременным упрощением способа.Эта цель достигается тем, что при осуществлении способа получния тимоцитарного антигена путем гомогенизации исходного сырья, выдерживания полученной суспенэии клеток в инкубационной среде с последующими центрифугированием, диализом надосадочной жидкости и лиофилизацией целевого продукта предлагается в качестве исходного сырья использовать тимус, суспенэию клеток выдерживать в изотонической среде при 44,5-45 С в течение 58-б 5 мин, диалиэ вести против дистиллированной воды и лиофилизацию проводить непосредственно после диализа.Способ осуществляют в несколько этапов.351, Получение клеток тимуса.Сразу после забоя крыс тимус извлекают и помещают в охлажденную среду 199. Клетки получают, используя стеклянный гомогенизатор со сла бо пригнанным поршнем. Взвесь клеток (3 10в 1 мл) в среде 199 отмывают центрифугированием (1500 об/мин) и ресуспендируют в исходном объеме,2. Отделение антигена. тимоцитов 45 от клеток.Ресуспендицированные тимоциты (концентрация б 10 клеток в 1 мл) нагревают в течение 1 ч при 45 С. Прогретую суспензию клеток центрифугиру ют 10 мин (1500 об/мин). Надосадочную жидкость отбирают, помещают в целлофановые трубки для диализа и диализируют в течение 2 суток против дистиллированной воды, Содержимое трубок лиофилизируют. 55Антитела иэ сыворотки получают путем осаждения глобулинов сульфатом аммония при 50-ном насыщении.Полученный препарат обладает выраженной активностью тимического ан тигена. К полученному антигену тимуса крыс получают антитимоцитарную сыворотку, для этого в подушечки лап кроликов вводят адъювант фрейнда (по 0,25-0,30 мл) . Через 10 дней в подколенные лимфатические узлы вводят по 0,25 мл смеси антигена с.адъювантом (15 мл сухого препарата анти- гена +0,5 мл Физиологического раствора +1 мл адъюванта) . На иммунизацию одного кролика идет 7 мг сухого пре- парата. На 27-ой день получают иммунную сыворотку, которую испытывают на цитотоксичность и специфичность.В табл. 1 приведены результаты этой оценки, в табл. 2 - для сравнения сыворотки, полученной по известному способу.Как видно иэ приведенных в табл.1 данных, результаты проверки свидетельствуют о большой активности и специфичности исследуемых сывороток по отношению к тимоцитам.Результаты, приведенные в табл. 2, подтверждают данные о специфичности и активности сыворотки, полученной по предлагаемому способу, которая не уступает по активности сыворотке, полученной по известному способу.Проводят также реакцию торможения цитотоксической активности сыворотки, полученной по предлагаемому способу. Эту реакцию осуществляют смешиванием равных объемов сыворотки и препаратов тимоцитов и костномоэговых клеток крыс (от 5 х 10 клеток). Инкубаты выдерживают в течение ночи и ставят реакцию, Результаты реакции торможения цитотоксичности антисыворотки представлены в табл. 3.Как видно иэ всех приведенных таблиц, результаты проверки полученных по предлагаемому способу сывороток указывают на их специфичность и активность по отношению к тимоцитам тех животных, иэ которых они были получены.Использование предлагаемого способа не требует применения дорогостоящего оборудования и реактивов. Для приготовления антигенного материала можно использовать практически неограниченное количество клеток тимуса от любого вида животных и человека.1Получение антигена не требует разрушения клеток, что обеспечивает большую чистоту препарата.Выделенный по предлагаемому способу антиген может быть использован для получения высокоспецифичной и высокоактивной сыворотки для экспериментальных и лечебных целей.% Цитотоксический индексс костномозговыми клетками,ф 1 крол. 2 крол. 1 крол. 2 91 91 7,5 4,3 68,1 82,4 73,6 Таблица 2 Активность и специФичность антитимоцитарной сыворотки к клеткам мышей (по цитотоксическому индексу)Цитотоксический индекс,Ъ Разведениесыворотки Сыворотка со спленоци- с костнотами мозговымиклетками с тимоцитами 15 12(печенью, 8эритроцитами) 16 Сыворотка пометоду Голуб 48 31 37 16 24 32 Неабсорбированная сыворотка 2 4 8 16 100 1-3100 живых100 клеток100 в п.зр. 98 96 96 100 93 96 87 44 36 39942281 Таблица 3Торможениецитотоксичности антитимоцитарной сывороткив присутствии клеточных препаратов Битотоксический индекс для получения,Ъ Разведениесыворотки антнсыворотки 82 93 85 75 80 80 22 77 69 Составитель С,МалютинаТехред А.Бабинец Корректор Л.Шеньои Редактор О.Кузнецова Заказ 4024/4 Тираж 688 ,ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патентф, г. ужгород, ул.Проектная, 4 той же сыворотки в присутствии препарататимоцитов той же сывороткив присутствиипрепарата клетоккостного мозга