Способ определения поверхностных белков легочной ткани

Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ оц 941882(511 М КП з с присоединением заявки Мо С 01 К 1/28А 61 В 10/00 Государственный комитет С С СР но делам изобретений н открытийДата опубликования описания 07.07,82(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИИзобретение относится к медицине, а именно патоморфологйи.Известен способ определения поверхностных белков легочной ткани путем ее Фиксации перфузией в легочные сосуды с последующим окрашинием и электронно-микроскопическим изучением 1 .Однако известный способ имеет низкую точность из-за наличия трудоемких и длительных по времени иммуногистохимических операций, связанных с необходимостью получения специфических антител на поверхностные белки легочной ткани и их последующей обработки для выявления под трансмиссионным электронным микроскопом. Цель .изобретения - повышение точности способа.Эта цель достигается тем, что при осуществлении способа определения поверхностных белков легочной ткани путем ее фиксации перфуэией в легочные сосуды с последующим окрашиванием и электронно-микроскопическим изучением, фиксацию и окрашивание проводят в среде следующего состава: 0,2-0,3-ный проционовый ярко-голубой Н 568; 3,6-ный глутаровый альдегид, 0,2 М какодилатный буфер рН. 5,6-6,0, взятых в соотношении 11 г 1,при этом перфузию проводят в течение10-15 мин под давлением 25-30 см вод,ст., далее легочную ткань выдерживают в том же составе в течение 1,52,0 ч и затем в насыщенном растворетиосемикарбазида в в течение 2030 мин. Способ осуществляют следующим образом.Легкие в течение 10-15 мин под давлением 25-30 см вод.ст. перфузируют 1 п э 1 си через легочную артерию фиксирующе-красящей смесью, содержащей равные объемы 0,2-0,3-ного водного раствора проционового ярко-голубого Н 568, 3,6-ного глутарО ваго альдегида й 0,2 М какодилатного буфера РН 5,6-6,0, Далее легкое выделяют из грудной полости и помещают в тот же состав еще на 1,5- 2,0 ч. Затем легочную ткань режут на 1-2 см кусочки, выдерживают 20-30 мин в насыщенном водном растворе тиосемикарбаэида, дофиксируют 30 мин 1 0504 и подготавливают для электронно-микроскопического исследования обычным способом.П р и м е р 1Легкие трех морс,ких свинок поочередно отмывают открови путем пропускания физиологического раствора через легочную артерию в течение 2-3 мин под давлением 30 см вод.ст. Затем доступ. Физиологического раствора прекращают и в течение 3 (1-я морская свинка), 10 5 (2-я) или 30 мин (3-я) через легочную артерию в том же режиме пропускают Фиксирующе-красящую смесь, содержащую равные:объемы 3,6-ного глутаральдегИда, 0,2 М какодилатного бу"10 фера рН 5,6-6,0 и 0,3-ного водногораствора проционового ярко-голубого Н 568. Далее материал обрабатывают по схеме, приведенной в описании способа, 15При электронно-микроскопическом изучении материала установлено, что трехминутная перфуэия легкого Фиксирующе-красящей смесью является недостаточной, так как продукт Реак ции на поверхности альвеолярного эпителия выявлялся нерегулярно, в отдельных йебольших участках срезов ткани. Этот недостаток устранен 1 при 10- или 30-минутной перфузии25 легкого фиксирующе-красящей смесью, Причем между этими сроками перфузии не выявлено существенных раз,личий по степени выраженности и равномерности распределения про дукта реакции.Поскольку при 30-минутной перфузии расходуется большее количество реактивов, что экономически менее выгодно, в качестве наиболее оптимального выбрано время перфузии 10-20 мин.П р и м е р 2. Легкие морской свинки отмывают от крови путем пропускания физиологического раствора че рез легочную артерию в течение 2-3 мин под давлением 30 см вод.ст. Затем доступ Физиологического раствора прекращают и в течение 10 мин через легочную артерию в том же ре" жиме пропускают Фиксирующе-красящую 45 смесь, содержащую равные объемы 3,6 глутаральдегида, 0.,2 М какодилатного буФера рН 5,6-6,0 и 0,3 водного раствора проционового ярко- голубого Н 568 Затем вырезают 50 несколько 5-6 сии сегментов легочной ткани и помещают их в свежие порции Фиксирукице-красящей смеси на 30 мин, 1 или 2,5 Ч. Далее весь Ма= териал обрабатывают по схеме, при веденной в описании способа.1При электронно-микроскопическом изучении материала установлено, что 30 мин не достаточно для полного проникновения фиксирующекрасящей 60 смеси вглубь 5-6 смЗ кусочков ткани, так как продукт реакции отчетливо выявляется только на первых .ее срезах. При обработке 5-6 смф Кусочков фиксирукице-красящей 65 смесью в течение 2,5 ч во многих клетках альваолярного эпителия обнаружено набухание митохондрий, что рассматривалось нами как артефакт фиксации, обусловленный длительным пребыванием материала в фиксаторе при комнатной температуре, необходимой для более быстрого проведения гистохимической реакции. При обработке 5-6 см кусочков в течение 1 ч фиксирующе-красящая смесь более равномерно проникает в толщу кусочков и не вызывает сильного набухания митохондрий в клетках. Поэтому 1-1,5-часовая обработка фиксирующекрасящей смесью кусочков данного размера выбрана как оптимальная.П .р и м е р 3, Легкие морской свинки отмывают от крови путем про" пускания. Физиологического раствора через легочную артерию в течение2-3 мин под давлением 30 см вод.ст. Затем доступ физиологического раствора прекращают и в течение 10 мин через легочную артерию в том же режиме пропускают Фиксирующе-красящую смесь, содержащую равные объемы 3,6-ного глутаральдегида, 0,2 М какодилатного буфера рН 5,6-6,0 и 0,3-ного водного раствора проционового ярко-голубого Н 568. Вырезают.5-6 см сегментов легочной ткани и помещают в эту же смесь сначала на 1 ч, а после дополнительного измельчения кусочков до 1-2 см еще3 на.30 мин. Материал 10 мин промывают 0,1 М какодилатным буфером рН 7,3-7,4 и разделяют на три части (по 3-4 кусочка в каждой), Одну часть кусочков обрабатывают насыщенным водным раствором тиосемикарбазида 10 мин, другую - 30 мин, третью - 60 мин. Дальнейшую подготовку материала для электронной микроскопии проводят по общей схеме, приведенной в описании способа, При электронно-мнкроскопи" ческом изучении материала установлено, что 10-минутная обработка кусочков тиосемикарбазидом не достаточна так как продукт реакции на срезах выявляется главным образом в: виде следов, Необходимо увеличить время промывания материала в -какодилатном буфере до 1 1,5 ч (3-4 смены по 20-25 мин)В противном случае, при погружении кусочков в Оэ 04, последний выпадает в осадок. Длительное.промывание материала после 60- минутной обработки тиосемикарбаэидом не только увеличивает общую продолжительность предлагаемого способа выявления белков легочного сурфактанта под трансмиссионным электронным микроскопом, но и приводит к дополнительному расходу какодилата Иа для буфера, что нежелательно. Поэтому время обработки кусочков тиосемикарбазидомсокращено до 20-30 минОно достаточно для проведения гистохимической реакции хорошего качества и требует не более 15 мин для промывания материала н буфере.П р и м е р 4. В эксперименте использовано четыре крысы.Под гекссаналовым наркозом нскрывают грудную клетку животного. Легкие отмывают от кровки путем перфузии Физиологического раствора через легоч ную артерию в течение 2-3 мин. Затем доступ Физиологического раствора прекращают и н течение 10-15 мин через легочную артерию пропускают одну из двух фиксирующе-красящих (5 смесей. Фиксирующе-красящая смесь Р 1 содержит равные объемы 3,6-ного глутаральдегида, 0,2 М какодилатного буфера рН 5,6-6,0 и 0,2-0,3-ного водного раствора нроциононого ярко голубого Н 568, :(проперфузированы 2 крысы). фиксирующе-красящая смесь Р 2 н качестве красителя содержит 0,3-ный водный раствор проционового ярко-голубого ЙЗ (проперфузированы 2 крысы), Вся дальнейшая обработка материала подводится в соответствии с предлагаемым способом. При просмотре материала под трансмиссионным электронным микроскопом у крыс, легкие которых обрабатывают фиксирующе-красящей смесью Р 1, н состане сурфактантного альнеолярного комплекса выявлен мелкогранулярный продукт реакции, обладающий высокой электронно-оптической плотностью, В том случае, если легкие обрабатывают фиксирующе-красящей смесью Р 2, продукт реакций под трансмиссионным электронным микроскопом не ныянляется. 40 1П р, и м е р 5. У крыс и морских свинок с экспериментально вызванньм альвеолярным липопротеинозом вскрывают грудную клетку, Через надрез в предсердии в легочную артерию вводят иглу с наболдашником и в течение 2-3 мин через малый круг кровообращения под давлением 25-30 см вод,ст. пропускают физиологический раствор. После того как легкие отмы ты от крови, доступ физиологического раствора прекращают и в течение 10- 15 мин через легочную артерию пропускают фиксирующе-красящую смесь, содержащую равные объемы З,б глутаро ного альдегида, 0,2 М какодилатного буфера рН 5,6-6,0 и 0,2-0,3 водного раствора проциоового ярко-голубого, Вырезают 5 тб см сегменты легочной ткани и помещают их в фиксирующе красящую смесь сначала на 1 ч, а ,после дополнительного измельчения кусочков до 1-2 см , еще на 30 минЪпри комнатной температуре. Материал, 10 мин промывают 0,1 М какодилатным 65 буфером рН 7,3-7,4, помещают на 30 мин н насыщенный водный раствор тиосемикарбазида, затем вновь 15 мин промывают этим же буфером и в течение 30 мин дофиксируют 1-ным ОЗОна 0,1 М какодилатном буфере рН 7,3- 7,4 при комнатной температуре. Кусочки легочной ткани в течение 1 ч обезвожинают в ацетонах восходящей концентрации, окиси пропилена и после 1,5 ч пропитки в смеси окись пропилена+эпон-аралдит (1:1) при 37 С заключают в эпон-аралдит изонестным способом, В течение 24 ч материал находится в термостате на 60 С для полимеризации эпоксидной смолы. Затем получают ультратонкие срезы толщиной 50-60 нм, которые просматривают в трансмиссионном электронном микроскопе без дополнительного контрастирования.1Предложенный способ позволяет определить на поверхности альвеолярного эпителия продукт гистохимической реакции проционового ярко-голубого НБСБ в виде мелкогрануляр-( 1 ного материала, обладающего высокой электронно-оптической плотностью Появление крупных скоплений продукта реакции в просветах альвеол свидетельствует о развитйи альвеолярного липопротеиноза, а частота их нстречаемости в легком позноляет оценить степень выраженности заболевания у животного. По сравнению с известным, предлагаемый способ является более простым и позволяет сократить время, необходимое для определения поверхностных белков легочной ткани под трансмиссионным электронным микроскопом с 3 месяцев до 2-3 сут, упрощение и повышение точности способа обеспечивает хорошую воспроизводимость результатов в эксперименте, приводит к уменьшению экономических затрат на исследование и может применяться в клинике для диагностических целей.формула изобретенияСпособ определения поверхностныхбелков легочной ткани путем ее фиксации перфузией в легочные сосуды споследующим окрашиванием и электронно-микроскопическим изучением,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения точности сйособа,фиксацию и окрашивание проводят всреде следующего состава: 0,2-0,3 ный проционовый ярко-голубой. Н 5 СЯ3,6-ный глутароный альдегид, 0,2 Мкакодилатный буфер рН 5,6-6,0,взятых н соотношении 1;1:1, приэтом перфузию проводят в течение10-15 мин под давлением 25.-30 см вод,941882 Составитель Ю.ллмаэовРедактор Н.Пуыненкова ТехредЖ. Кастелевич .КорректорВ ВутягаМаа фа а ЮВ 61ШттЮ тв ыЭаказ 482732тираж 887 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва, ЖРауыская наб д. 4/5филиал ппП патент, г. Ужгород, ул. проектная, 4 ст., далее легочную ткань выдержи-.вают в том же составе в течение 1,5"2,0 ч и затем в насыщенном растворетиосемикарбаэида в течение 20-30 минИсточники информации,принятые во внимание при экспертизе. 5 1, Яце 1 в 1 с 1 Е., Тапка Т Ода Т., ХлшпипоцййгавйгиеСцгаУ в 1 цйу ой вцгйас 1 апй вувйев, Йезйг 1 ЪиС 1 оп ой врес 1 г 1 с ргоге 1 п ой вцгГасе асй 1 че паСег 1 аО 1 п гаЬЪ 1 й-Рипа. ЬаЪог.1 пуев 1 д, 1977, Ч 37, р, 130