Гептапептид в качестве стимулятора памяти пролонгированного действия

Союз СоветскихСоциапистическихРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ1939440(23)приоритетОпубликовано 30,06.82, Бюллетень 2 чДата опубликования описания 30,06, 82(51) М. Кл,С 07 С 103/52А 61 К 37/02 твсударствеиный комитет СССР вв деИаи изобретений н открытий(53) УД К 5 7. 96 й.ч(088,8) М,А,Пономарева-Степная, ВН.НЙавибатько,А, А, Каменский нЛ. В.ЯнтаноцаИнститут молекулярной генетикиена Ленина, ордена Октябрьской РТрудового Красного Знамени госудим.М,В,Ломоносова И, ,Ашмарин,(72) Авторы изобретения овскийенаверситет(71) Заявите 5 Й) ГЕПТАПЕПТИД В КАЧЕСТВЕ СТИМУЛЯТОРА ПАМЯТИ ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ обладавием,-Рго, (1)амяти проИ АКГТ по с мента сокой том ои оединепотерюсчет 1 м ие ар едств Изобретение относится к новомухимическому соединению, конкретнеек гептапептиду формулыМесц-Нв-РЬе-Рго-Осуявляющемуся стимулятором илонгированного действия.Известен гептапептид - фрагментАКТ Г,1 ,то фоРмУлыМе-О Рц" Н 1 в-РЬе-Агу-Тгр-СЗу,обладающий психофармокологицескойактивностью, в частности способносстимулировать память 111,звестен ряд аналогов фраобладающих более выравнению с нативным ФрагАКТГ(о психофармакологичактивностью 2.К недостаткам известных сний следует отнести быструюбиологической активности заферментативной деградации,Цель изобретения - расщиресенала стимулирующих память пролонгированным дейстПоставленная цель достигается гептапептидом формулыМес-С 1 ц-Н 15-РЬе-Рго-й 1 у-Рго.Синтез гептапептида формулы1) осуществляют известным методом 31 путем ступенчатого наращивания пеп тидной цепи, начиная с С-концевого дипептида с помощью дициклогексилкарбодиимида с добавкой оксибензотриазола с последующим отщеплением защитных групп трансферным гидриро ванием 1,1-циклогексадиеном в прис ствии палладиевой черни.Принятые сокращения:Вос - трет-бутилоксикарбонильнаягруппаВг 1 - бензильная группаБТ - оксибенз 1 риазолДЦГК - дициклогексилкарбоди ид ДЦМ - дициклогексилмочевина ДСНА - дициклогексиламмониевая сол ТГФ - тетрагидрофуран, ТФУ - трифторуксусная кислотаТФА - трифторацетатТЭА - триэтиламинЦГД - 1,4-циклогексадиенЭА - этилацетат 5КОнтроль за синтезом пептидовпроводят на пластинках марки "Силуфол" при опрыскивании растворомнингидрина или толидиновым реагентом, после обработки хлором в сис Отемах растворителей 1) н-бутанол:уксусная кислота: вода (5:1:2);2 ) хлороформ:метанол (14:1 ); 3) н-бутанол:уксусная кислот а: пиридин: вода:1:5).Все растворители абсолютируют со" 20ответствующим образом. Точки плавления не корректируют, Целевой продукт после отщепления защитных группподвергают кислотному расщеплениюкипячением в 6 н. нсвт в течение 2548 ч и затем исследуют в систе-ме растворителей 5 и 6 двухмерной хроматографией (тпдегрг 1 пС).Продукт гидролиза соответствуетЗОсодержанию всех аминокислот, входящих в состав пептида. Оптическоевращение измеряют на цифровом поляриметре марки нРегси-Е 1 щег",П р и м е р 1. Получение гептапептида Формулы (Т).Бензиловый эфир М-трет-бутилоксикарбонилпропилпролинаВос-Ргоу-Рго-ОВгВ,675 мг (3, 14 ммол ь) Вос-Р го-ОН40растворяю в 10 мл ТГФ, добавляют475 мг (3, 14 ммоль ) БТ, охлаждают до 0 С и добавляют 710 мг(3,42 ммоль) ДЦГК в 5 мл ТГФ. Послеперемешивания в течениец при комм 45натнои температуре к реакционнойсмеси добавляют четырьмя порциямив течение 2 ц раствор бензиловогоэфира ТФА Ну-Рго (3,14 ммоль)и 0,44 мл (3,14 ммоль) ТЭА в 1 О млТГФ, Реакционную смесь оставляют на3 сут при комнатной температуре,затем отфильтровывают ДЦМ, растворупаривают в вакууме, остаток растворяют в ЭА. Этилацетатный растворпромывают 0,1 М раствором НСЙ, НпО,54-ным раствором МаНСО, НО, а затем высушивают над Мд 50 и упариваат в вакууме. Оставшееся масло рас 4тирают с абс.эфиром, при этом постепенно отделяется порошкообразный осадок, который отфильтровывают и высушивают в вакууме.Выход 750 мг (534), Т.пл. 120122 С. Ру=0,65 (1); 0,74 (2),. Бензиловый эфир М-трет-бутилоксикарбонилгистидилфенилаланинаВос-Нз-РЬе-ОВг 0 син 1 езируют из10 ммоль М-трет-бутилоксикарбонилгистидина и 1 О ммоль и -толуолсульфоната бензилового эфира фенилаланина методом, описанным на 1 стадии с выходом 881, Т.пл. 164-166 С.Р 0,836 (3); 0,43 (1),Й, М-трет-бутилоксикарбонилгистидилфенилаланинВос-Н 5-РЬе-ОН,350 мг (0,76 ммоль) Вос-Н 5-РЬе-ОВг 2 растворяют в 5 мл метанола,добавляют Оу 5 мл уксуснои кислотыукатализатор - палладиевая чернь игидрируют при комнатной температурев течение 10 ч, После отфильтровывания катализатора и многократного промывания метанолом раствор упариваютв вакууме и остаток обрабатываютэфиром. Отделившийся осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме.Выход 270 мг (764). Т,пл, 173174 С. К=0,35 (1).1 Ч . Бензиловый эфир М-трет-бутилоксикарбонилгистидил-фенилаланилпропилглицилпролинаВос-Нв-РЬе-Рго-БЕу-Рго-ОВгф.500 мл Вос-Рго-С Ву-Р го-ОВг Рсуспензируют в 3 мл СНСР, добавляют 3 мл ТФУ и оставляют на 30 минпри комнатной температуре, упаривают и к оставшемуся маслу добавляютабс.эфир. Постепенно при выдерживании в холодильнике отделяется осадок. Эфирный слой сливают и процывают осадок несколько раз декантацией абс.эфиром, Высушивают в ва-,куум-эксикаторе,Выход количественный, Р=0,01(1); 0,085 (2).Из 240 мг (0,51 ммоль) полученного трифторацетата бензилового эфира глицилпролина и 250 мг (0,62 ммоль)М-трет-бутилоксикарбонилгистидилфенилаланина методом, описаннымна стадии 1, синтезирован бензиловый эфир М-трет-бутилоксикарбонил- гистидилфенилаланилпропилглицилпролина с выходом 72. Т.пл . 160- 162 С,Ру=0,27 (1); 0,08 (2).939440 5Бензиловый эфир М-трет-бутилоксикарбонил-) бензилглутамилгис- тидилфенилаланилпролилглицинпролина.Вос" С Уц" (ОВг Р) -Нэ "РЬе-Рго-С УуР.го ОВг Ре260 мг (0,50 ммоль) Вос-СРц(ОВгВ)- -ОН ОСНА суспензируют в 10 мл эфира, добавляют 4 мл 0,2 н, Н 50 и многократно встряхивают в делитепьчО нои воронке для удаления ДСНА, Вос-СРц(ОВгГ)-ОН при этом растворяется в эфире, Эфирный слой отделяют от водного и многократно промывают водой до рН 7. После высушивания . 1 над М 00 эфирный раствор упаривают в вакууме и оставшееся масло высушивают в вакуум-эксикаторе.Вос-Нэ-РЬе-Рго-Сйу-Рго-ОВгй суспенэируют в 3 мл СН, СЙ, добав- го ляют 3 мл Тфу, оставляют на 30 мин при комнатной температуре и упаривают в вакууме. К остатку добавляют абс. эфир и гэмещают в холодильник. Выпавший осадок отделяют от эфирного слоя, несколько раэ промывают абс, эфиром и сушат в вакууме.гВ итоге с выходом 913 получают 2 ТФА-Н-Нэ-РЬе-Р го-С Фу-Р го-ОВг Р. Зв В=0,10 (1); 0,06 (2).Далее Вос-С Уц(ОВг Р) -ОН растворяют в ТГФР добавляют 50 мг (0,37 ммолы БТ охлаждают до ООС,прибавляют 80 мг (0,39 ммоль) ДЦГК в 3 л ТГф и перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее прибавляют четырьмя порциями в течение 2 ч 300 мг (0,31 ммоль) 2 ТфА-Н-Нэ-РЬе-Рго-СЗу-Рго-ОВгГ. Реакционную смесь перемешивают 3 сут при комнатной температуре и обрабатывают аналогично стадии 1 Выход 250 мг (765 Ж). Т.пл. 168- 170 ОС. В=О 30 (1)0,01 (2).и, Бензиловый эфир М-трет-бутилоксикарбонилметионилбенэилглутамил- гистидилфенилаланилпролилглицилпролинаВос-Ней-Г Рц (ОВ г У) -Нв-РЬе-Р го- -Г,Юу-Рго-ОВгУПолучают из Вос-Мей"ОН ОСНА и Вос-С Рц(ОВ г Р) -Нэ "РЬе-Р го-С Йу-Р го-" -ОВгЕ методом, описанным на стадииУ, с выходом 584.т.пл. 98- 100 ос. Ву=084 (3)Р 0,79 (4); ы 311 з,0 с=012 АсОн). 611 М-трет-бутилоксикарбонилметионилглутамилгистидилфенилала"нилпролилпролинВос-Мей-СРц-Нь-РЬе.-Рго-СРу-Рго-ОН,75 мг (0,062 ммоль) Вос-Мес-СРу(ОВг 1 Р)-Нэ-РЬе-Рго-СРу-Рго-ОВгГкипятят в 0,5 мл этанола и 0,5 мл1,4-циклогексилдиена в присутствии15 мг палладиевой черни в течение2 ч. Затем катализатор отфильтровы-вают и многократно промывают этанолом. Объединенный фильтрат упаривают. Остаток растворяют .в 0,5 мл абс.метанола и осаждают добавлением абс.эфира.Выход 48 мг (76 ); В=О 26 (1);0,96 (4).ф. МетионилглутамилгистидилфенилаланилпролилглицилпролинН-Мей-С Ь-Нэ-РЬе-Р го-Г Ру-Р го-ОН,48 мг Вос-Нес-Г Ь-Нэ-РЬе-Р го-СРу-Рго-ОН растворяют в 0,5 мл1 н НСУ/АсОН и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Затем добавляют абс.эфир, выпавший осадокотфильтровывают, промывают несколькораз абс, эфиром и высушивают ввакууме. В итоге получаю 1 25 мг (573)Н-Не-Си-Не-РНе-Рго-Су-Рго"СН.ВУ=ОР 09 (1) Р 0,94 (4); АЗР -(1,О),Проводили сравнение природногоФрагмента ЛКТГ,1 ои гептапептидаформулы ( 1) по способности стимулировать память у живо 1 ных, Исследуемые пептиды вводили внутрибрюшинно вводном растворе самцам нелинейных белых крыс весом 150-200 г за 30 мини за 1 ч до момента обучения. Конт"рольным животным вводили внутрибрюшиннодистиллированную воду. Обучение крыспроводили в Т-образном лабиринте спищевым подкреплением: крыс в тече"ние 4 дн обучали находить пищу .вТ-образном лабиринте. При этом фиксировали время, необходимое для поисков пищи и скорость обучения животных.Полученные результаты приведены втаблице.Количество невыполненных реакцийу крыс, которым вводили эа час дообучения НО, АКТГ о 0,01 мг/кг,и гептапептид формулы 11 0,015 мг/кг.939440 Невыполненные реакции, 4 при введении День обучения Гептапептид формулы 1) Н О АКТ Г 1-1 о 40 46 46 22 37 34 Составитель О,Галкин Техред Л, Пекарь Корректор А. Гриценко Редактор Л.Пчелинская Заказ 4587/35 Тираж 445 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Иосква, Ж, Раущская наб., д.4/5Филиал ППП "Патент", г,ужгород, ул,Проектная,4 Из т аблицы видно, что внут рибрюви нное введение гепт апептида формулы (1) в дозе 0,015 мг/кг.,за 1 ч до обучения достоверно снижает число невыполненных реакций, т.е. ускоряет обучение. Природный пептид ЯКТГ А. 1 у при введении через 1 ч сказался неэффективным.Таким образом, гептапептид Формулы 1) обладает пролонгированным действием при стимуляции памяти животных по сравнению с природным фрагментом АКТГ,1,1 С.формула изобретенияГептапептид формулыМе 1-С 3 и-Н 1 з- РЬе-Р го-С Ву-Р го в качестве стимулятора памяти пролонгированного действия,Источники информации,принятые во внимание при экспертизетоАамарин И,П.,Еропкин И,Ю.,Ковалева Т.А., Рожанец В.В. Олиго"пептиды мозга - анальгетики, стимуляторы памяти и сна. - Молекулярнаябиология", т,12, 8 5, с.965-979