Способ иммобилизации оксидоредуктазных ферментов

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПА ТЕЯУУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик(1 Ц 618048й.";ФР Гт 1 тт ". р. 161) опол ный к патенту 22) Заявлено 09,07.76(21) 23) Приоритет - (32) М, К С 07 825 10/23-04 07,7 Государственный комитет Совета Министров СССР па делам изооретений и открытий) Дата опубликования оп Иностранцыальтер Маркони, СиФранко Моризи(Италия) Ц 2) Авторы изобретения Джулио Пр ия Джиовен Иностранная фирма Снам Прогетти С, п,(Италия)) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ОКСИДОРЕДУКТАЗНЬ ФЕРМЕНТОВ Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментных препаратов, а именно к способу получения иммобилизованных в волокнах оксидоредуктаз. Препараты, полученные данным способом, могут найти применениев тонком органическом синтезе, в аналитической химии и в лабораторной практике. Известно, что иммобилизация фермен О тов на различных нерастворимых в воде носителях позволяет увеличить продолжительность использования ферментов и обеспечивает их технологичность 1, Особые трудности при иммобилизации встречаются р в случае оксидоредуктаз, поскольку проявление ферментативной активности этими ферментами обязательно связано с наличием в реакционной среде кофермента типа никотинамидадениндинуклеотида (НАД). При 20 этом НАД легко. диссоциирует из комплексов с ферментами и поэтому при циклических операциях с иммобилизованными оксидоредуктазами необходимо каждый раз вводить в реакционную смесь весьма дорого стоящий кофактор, который в последующем теряется в ходе очистки выделямых из реакционной среды продуктов. Это является серьезным ограничением для использования иммобилизованных оксидоредуктазных систем.Известен также способ получения ферментсодержаших волокон, заключающийсяв том, что фермент в виде эмульсии или суспензии или раствора в растворителе полимера добавляют в прядильный раствор полимера, из которого затем формуют волокно в условиях,. не оказывающих дезактивируюшего действия на ферменты 2,Однако этот способ в отношении к НАД- зависимым оксидоредуктазам имеет описанные выше ограничения.Цель предлагаемого способа - устранение недостатков известного способа.Для этого предложен способ, в котором при формировании волокон, содержащих апоферменты оксидоредуктаз, осуществляют одновременное включение в волокна иммобилизированного на водорас 1 вор - мом поликатионите НАД, Указанная операция приводит к сохранению активности оксидоредуктаз в иммобилизованном состоянии. Полученные препараты не требуют добавленияв реакционную среду НАД при циклических процедурах получения продук тов ферментативных реакций, катализируемых оксидоредуктазами, что резко улучшает технологические свойства полученных препаратов. Кроме того, поскольку в волокна включают одновременно два окси доредуктазных апофермента, при получении продуктов ферментативного превращения происходит рециклизация иммобилизованного НАД за счет сопряженной реакции, катализируемой вторым оксидоредуктазным ферментом. Рециклизацию НАД можно проводить не только энзиматическим путем, за счет включения в волокно второй оксидоредуктазы, но и химическим путем,когда в волокно включена только одна окси 20 доредуктаза, а возвращение НАД в цикл осуществяется с использованием химического соединения, Система рециклизации выбирается в зависимости от продукта, ко 25 торый желательно получить. Согласно изобретению описывается способ иммобилизации оксидоредуктазных ферментов, зависимых от НАД, с сохранени-ем ферментами биологической активностии с улучшенными технологическими свойствами путем одновременного включенияв волокна .полимера на основе триацетилцеллюлозы иммобилизованного на водорастворимом поликатионите НАД и апоферментов оксидоредуктаз,Предпочтительно процесс проводят следующим образом.Готовят водный раствор, содержащийферменты, подлежащие включению в волок40на и иммобилизованный на поликатионите(полиэтиленимине или полилизине) НАД.Далее растворяют триацетилцеллюлозу вхлористом метилене в соотношении 1:14,и к этому раствору добавляют вышеуказанную смесь и соотношении водный раствор органическая фаза, равном 1:7.Эмульгирование двух фаз интенсифицируоют энергичным перемешиванием при О Св течение 30 мин.Эмульсию выливают в открытую емкость выдерживаемую при О С и ведутОпрядение в атмосфере азота. Нити коагулируют в толуоле при О С и собирают наОкаркасе катушки. Для удаления органичес 55ких растворителей производят сушку волокон на воздухе. Полученные препараты используют многократно для получения продуктов ферментативных реакций, катализируемых оксидоредуктазами,П р и м е р 1, В смеси буфера и г;.ицерина (75:25) растворяют полиэтиленимин-НАД /РЕЗ-НАД/ (37,5 мг/мл,0,63 мкмоль НАД в мл), лактатдегидрогеназу (препарат из мышц кроликов фирмы"ВоеЬ ие; Иажйе щДиЬНв концентрации 17,5 мг/мп и апаниндегидрогеназу(препарат из В. би Ь 0 2 ь фирмы ЗоеИгпДе, МаПИЕ ж ДиЬ Н") в концентрации3,75 мг/мл.10 г триацетилцелпюпозы ВЬЮ С,Ь Ы СЙ 8 ) растворяют при перемешивании в реакторе в 133 г хлористого метипена, к раствору полимера прибавпяют20 г раствора энзима и эмульгированиедвух фаз интенсифицируют энергичнымперемешиванием при 0 С в течение 30 мин.оЭмульсию выпивают в небольшой плавильный тигель, выдерживаемый при темпера;уре 0 С и прядение ведут в атмос- Офере азота.оНити коагулируют в толуоле при 0 Си собирают на каркасе катушки,Для удаления органических растворителей производится сушка на воздухе, 2 гсвежеполученного вопокна, что соответствует примерно 1 г сухого полимера,промывают бикарбонатным буферным раствором с рН 8,0 для удаления непрочносвязанных ферментов и РЕ Д - НАД, азатем вонокно помещают в 10 мп 3%-ного водного раствора 1. -лактама аммония,рН 7,4. Производят перемешивание прикомнатной температуре в течение 10 ч.Далее с помощью анализатора аминокислот определяют количество образовавшегося 1 -аланина. Оно составvяет 0,163 г(96% от теории).То же волокно повторно вводят вконтакт со свежим раствором лактатааммония, После 7 циклов использованияпроцентное содержание- апанина составляет 94% после 10 ч инкубации,После 33 цикла оно составляет соответственно 90%. 1- Алании выделяют осаждением этанолом при рН 6,2;сц 1==+14,6 (с=2,05 н, НСЗ),П р и м е р 2. 2 г волокна, полученного как в примере 1, промывают0,05 М фосфатным буфером, рН 8 ипомешают в 10 мл водного раствора6180кого, То же волокно повторно помешаютв 10 мп аналогичного раствора и раствор заменяют через каждые 7 ч, Через30 дней непрерывной работы содержаниеапанина после 10-часового цикла составпяет 95% от теоретического.П р и м е р 3, Волокно готовят, какэто описано в примере 1, но с заменойРЕ 5 -НАД на попипизин-НАД. Реакциюведут анапогично примерам 1 и 2, В пер- О1 Овом цикле через 10 ч содержание аланинасоставляет 92% от теоретического, Через30 дней испопьзования достигается 87%степень превращения.15П р и м е р 4, Ферментсодержашийраствор готовят растворением компонентв смеси буфер-глицерин (75;25);,РЕ 0 -НАД 25,5 мг/мп (3,78 мкмопьНАД/мп); дегидрогеназа 3- сс -2 ф --оксистероида (фермент из 518 р 10 тусЕБмудюфемаибфирма "Ваеьч цДе, мащ ме 1 а,С 11 йЬН , 12,5 мг/мл (225 ед/мл, 25 С, этанопв качестве субстрата); апьдегиддегидрогеназа (фермент из дрожжей, фирмаи 5 Фа,М,О 11 з") 30 мг/мл (90 ед./мп, 25 С,ацетапьдегид в качестве субстрата), Волокно готовят как в примере 1,2 г волокна, соответствующие 1 г0сухого полимера, промывают при 25 Св 10 мм буферного раствора триэтанопамина (0,1 М, рН 7,3), содержащего0,3 М КС 2 . 5 мпмопь/Ь -меркаптоэтаноп и 1% этаноп. При этой операции под3действием дегидрогеназы спирта и дегидрогеназы альдегида РЕ 0 -НАД превращается в свою восстановленную форму,Далее врлокно помещают в свежийбуферный раствор (10 мп) того же соста 40ва, содержащий дополнительно 2 мг кортизона (Ь 4 прегнен-Ж -21-диоп, 11,20-трион). Раствор перемешиваютпри 25 С в течение 1 ч. Затем отделяютоволокно и раствор экстрагируют 3 порциями хлороформа по 2 мп, органическийэкстракт концентрируют в вакууме дообъема 1 мл и определяют кортизон иЬ 4-прегнен- 6 -20- ф -21-триоп, 1 1-дион,Степень превращения составляет 95 О/о.Тот же образец волокна использован в20 циклах превращения с незначитепьным снижением активности,П р и м е р 5, ферментосодержащийраствор готовят растворением компонентов в смеси буфер - глицерин (75:25);РЕ 3- НАД 25,5 мг/мп (3,78 мкмольНАД/мп); дегидрогеназа)3- оксистероида 48 б(фермент из Рбецдатеиав 1 ев 1 об 1 егои фирма"5 ща,бЛ,опа" сорт Щ, 40 мг/мп; диафораза (фермент из сердца, свиньи, фирма "ВоеИгифе" МаииИе 1 т маркаИ ) 19,4 мг/мп (содержит 6,45 мг/мп энзиматического бенка).Волокно готовят как в примере 1.2 г волокна промывают буферным раствором триэтаноламина (0,067 М рН 7,6) и помешают в 10 мп того же буфера, ссдержащего 288 мг тестостерона (17 -окси-ь 4-андростен-он) и, 2,9 мг 2 6-дихпорфенопиндофенопа. Раствороперемешивают при 25 С при пропускании через него кислорода дпя окисления восстановпенного красителя.Через 4 ч смесь экстрагируют тремя порциями этипацетата по 3 мп, органический экстракт сушат безводным супьфатом натрия, фипьтруют и упаривают досуха. Твердый остаток растворяют в 0,5 мп метанола и определяют копичество продукта Ь 4-андростен, 17-диона, Оно составляет 90%, из расчета на исходный тестостерон.П р и м е р 6. Испопьзуется то же волокно, что и в примере 5. 1 г вопокна, соответствующий 0,5 г сухого попимера промывают буферным раствором гидрохпорида триэтанопамина, 0,06 М, рН 7,6. Приготовлены пять растворов, содержащих буферный раствор гидрохпорида триэтаноламина, 0,06 М, рН 7,6, 2,6- -дихпорфенопиндофеноп, 80 мкмопь и тестостерон ( 17 ф -окси- Ь 4-андростен- -3-он); 10 мкмоль, 20 мкмоль, 30 мкм оль, 40 мкмольи 50 мкмоль, 1 гпромытого вопокна помещают в 5 мп каждого раствоора и смеси перемешивают при 25 С, измеряя оптическую плотность при длине волны 600 нм. Построена калибровочная прямая, на которой откладывают разности оптической ппотности. То же вопокно повторно испопьзовано дпя опредепения тестостерона в растворе, который содержал его в концентрации 30 мкмопь. Во время ста отсчетов отклонений от капибровочной кривой не обнаружено,Формула изобретения1. Способ иммобилизации оксидоредуктазных ферментов, зависимых от никотинамидадениндинукпеотида (НАД) путем вкпючения их в волокна полимера на основе триацетипцеллюлозы, о т л и ч а ю ш и й с я618048 Составитель Л, БочаровРедактор Л, Герасимова Техред Н, Андрейчук Корректор И. Гоксич Заказ 4705 Тираж 559 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Б, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП фПатент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 тем, что, с целью сохранения активности иммобилизованных оксидоредуктаз, осуществляют одновременное включение в вопокна иммобилизованного на водорастворимом поликатионите НАД и апоферментов оксидоредуктаз,2. Способпоп. 1, от ли ча ющ и й с я тем, что водорастворимыми по попикатионитами являются полиэтиленимини попилизин.Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе:12 ищоЬбхед Ьпрпеы,оя.каЬо гвкч,СЯС 7 еьь, 1974.2. Патент ССОР Ио 364173, кл.кл 2 011/10, 26.06,68,