Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы

Союз Советских Социалистических Республик(22 исоединением заявки23) ритет -Государственный комитет Совета Министров СССР(088.8) ллетень13ния 20.04.78 публиковано 05.04.78,(4 елам изобретеиии открытий ата опубликсват(72) Авторы изобретени В, Л, Яровенко, А. К. Овч В. Римарева, С. В. Рогож С, М. Андреев и Б. а,вич,ов, Н. В, Голубн, Ю, А. ДавиУстинников 71) Заявители есоюзиыи научно-исследовательскии институтодуктов брожения и ордена Ленина институтлементоорганических соединений АН СССР(54) СПОСОБММОБИЛИЗОВА ОЛУЧЕНИЯОЙ ГЛЮКОАМИЛАЗЬ 61) Дополнительное к авт. Настоящее изобретение относится к способу получения нерастворимых ферментных препаратов, а именно к способу .получения иммобилизованных препаратов фермента,глюкоамилазы (КФ 3,2.1,1), который широко 5 применяется в промышленности. Этот фермент используют для получения глюкозы из крахмалсодержащего сырья с целью последующего выделения из гидролизатов кристаллической глюкозы. Глюкоамилаза используется также в производстве пиза, спирта и некоторых других продуктов. Внедрение з промышленность препаратов иммобилизованной глюкоаоаилазы приведет к существенному снижению экономических затрат.15,В качестве полимерных матриц и неорганических носителей широко используют ионообменную целлюлозу и различные активированные редкоземельными металлами и актизированные химически подложки из керами ческих материалов 1,Основной недостаток указанных способов получения иммобилизованной глюкоамилазы заключается в том, что получаемые препараты обладают малой механической прочностью и высоким гидравлическим сопротивлением при использовании их в реакторах колонного типа. При использовании в качестве матрицы .ионообменной целлюлозы,препараты глюкоамилазы подвергаются микробиологическому З 0 разрушению и заражению, а керамические матрицы активированы дорогостоящими редкоземельными металлами (Ъ, Т 1 и др.). Общий недостаток указанных способов заключается з низкой удельной активности препаратов глюкоамилазы и в многоэтапности осущестзления процесса иммобилизации.Из известных способов получения иммобилизованной глюкоамилазы по технической сути и достигаемым результатам к настоящему изобретению наиболее близким является способ получения иммобилизованной глюкоамилазы путем конденсации фермента с частицами анионного гщдрофильного геля 2.Однако этот способ обладает рядом существенных недостатков. Частицы геля стабиль. чы только при рН 6,0,реакционной среды и выше, при более низких значениях рН гранулы сжимаются и происходит значительная потеря их активности. Субстраты и конечные продукты ферментативной реакции должны быть в,нейтральной или анионной форме. Кислые продукты реакции адсорбируются на анионной матрице и значительно ингибируют катализ.Необходимо отметить, что в указанном способе получения иммобилизованных ферментов за счет тройной сополимеризации частицы анионного гидрофильного геля имеют неупорядоченную структуру, что значительнопользования сополимера как в транулированном виде, так и в армированном состоянии или в виде покрытий значительно расширяет области применения полученного препарата.Пр имер 1. К 1100 г сололимера малеинового ангидрида и Х-винилпирролидона, растворенного в 500 мл диметилформамида, до бавляют 5 г 5 мол. /, 4,4-диаминодифенилоксида, растворенного в 50 мл диметилформамида, быстро размешивают, и в раствор вносят армирующую подложку (капроновую ткань), и выдерживают в течение 1 - 2 мин.Затем армированный сополимер высушивают в вакууме при 120 С, К полученному армированному ссполимеру добавляют 1000 мл ультраконцентрата культуральной жидкости Епд, Ь 1 эрога и выдерживают в течение двух суток при комнатной температуре. Затем иммобилизованную глюкоамил азу на армированном сополимере промывают водой и высушивают в вакууме при комнатной температуре. Глюкоамилазная активность составляет 3700 - 3900 ед,г сополимера, Выход по активности составляет 60 в 7 от исходной,П р и м ер 2. К 100 г сополимера малеинового ангидрида:и М-винилпирролидона, рас - творенного в 500 мл диметилформамида, доав ют 5 г 5 мол о/о 4,4-диаминодифенилоксида, растворенного в 50 мл диметилформамидабыстро размешивают и в,раствор вносят армирующую подложку (капроновую ткань), и выдерживают в течение 1 - 2 мин.35 Зате. армиро.анный сэпо; имер высушиваютв вакууме при 120 С. К полученному армированному сополимеру добавляют 1000 мл ультраконцентрата глюкоамил азы, разбавленного в 2 раза (15% сухих веществ), и выдер живают при комнатной температуре в течение двух суток. Глюкоамилазная активность составляет 4100 - 4300 едг сополимера. Выход по активности составляет около 90 - 95%от исходной.При м ер 3. К 100 г сополимера малеинового ангидрида и М-винилпирролидона, растворенного,в 200 мл диметилформамида, добавляют 3,82 г 4 мол, % 4,4-диаминодифенилоксида, растворенного в 20 мл диметил фор,мамида. Полученный гомогенный растворприливают при постоянном перемешивании к 300 О мл полиэтилсилоксановой жидкости (типа ПЭС). Образовавшуюся эмульсию нагревают при перемешивании в течение двух часов при 80 С. Полученные сферические гранулы отфильтровывают, промывают 400 мл ацетона, смесью уксусного ангидрида с диметилформамидом (2: 1) в количестве 300 мл, 4 ОО мл апетэна, 400 мл серного эфира и высуб 0 65 снижает емкость матрицы по каталитическиактивному белку. По приведенным авторамиданным гель состоит из б 7 мэл. % акриламида,32 мол. /, ангидрида метакриловой кислотысо сшивкой 0,5 - 1,0 мол. о/о М,Х-метилен-бисметакриламидом или этиленгликольметакрилатом, Ниэкая степень сшивки приводит .к получению сильно набухающего геля, частицыкоторого, имеют очень низкую механическую1 пр очность,Цель описываемого способа заключается вустранении недостатков известного способа иполучении препаратов иммобилизованнойглюкоамилазы с высокой активностью придэстаточно высоком выходе по глюкоамилазнэй активности. Указанная цель достигается засчет того, что в качестве нерастворимой подложки используют полимерные матрицы, синтезированные на основе малеинового ангидрида и,гидрофильных сополимеров.Необходимо отметить, что высокая адгезия гидр офильных сополимеров позволяетполучать их как в виде армированной пленки(в качестве армирующего материала могутбыть использованы синтетические ткани, металлическая сетка, гранулы инертного материала и т. л.), так и в гранулированном видебез армирующего материала.Наиболее перспективной полимерной ыатрицей для мобилизации глюкоамилазы является чередующийся сочолимер малеиновогоангидрида и М-винилпирролидона. В качествегидрофильных сомономеров можно использовать также акриловую и метаириловую кислоты, акриламид, Х-винилпиридин, В качестве сшивающих агентов можно использоватьэтиловый эфир лизина и 4,4-диаминодифенилсксид.Согласно изобретению описывается способполучения препаратов иммобилизованнойглюкоамилазы посредством конденсации фермента с полимерной матрицей, в качествекоторой используют сополимеры малеиновогоангидрида с гидрофильными сомономерами в,Процесс проводят следующим образом.К сополимеру малеинового ангидрида с гидрофильными сомономерами, растворенному вапротонном растворителе (диметилформамиде или его смеси с ацетономЛ, добавляют сшиающий агент в концентрации 2 - 10 мол. %,растворенный в апротонном растворителе, например диметилформамиде, и получают сшитый сополимер в .виде грабанул,или,в армированном виде (в случае внесения армирующейподложки). Сшитый сополимер промываютацетоном, спиртом и эфиром и высушиваютв вакууме при 120 С. Полученный сополимервводят во взаимодействие с ультраконцентратом культуральной жидкости Епд. Ь 1 эрога.Процесс иммобилизации проводят в течениео 1 дних-двух суток при комнатной температурепри перемешивании.Предполагаемый способ позволяет получать нерастворимые препараты глюкоамилазы, обладающие высокой удельнои активностью и большим выходом, а возможность исшивают в вакууме при 120 С. Выход составляет 100 г (100%) сферических гранул диаметром 0,2 - 0,5 мм.К 100 г полученного гранулираванного сополимера приливают 800 мл ультраконцентрата глюкоамилазы. Реакционную смесь вы 60128655 60 65 держивают в течение суток при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Препарат иммобилизованной глюкоамилазы отфильтрэвывают и тщательно прсмызают дистиллированной водой до отрицательной реакции на белок с 200/О раствором салициловой кислоты. Полученный препарат высушивают в вакууме при комнатной температуре.Глюкоамилазная активность полученного препарата составляет 4200 - 4500 ед,г сополимера. Выхсд по активности составляет 65 - 750/О от исходной.П р и м е р 4. 50 г сополимера малеинового ангидрида и акриловой кислоты растворяют в 50 юг смеси ацетона и диметилформамида (1: 1) при пэстоянном,перемешивании и добавляют 1,91 г 4,4-диаминодифенилоксида, растворенного в 10 мл диметилформамида, вливают при постоянном перемешивании в 2000 мл полиэтилсилоксановой жидкости (типа ПЭС). Ооразовавшуюся эмульсию нагревают.на масляной бане,з течение 4 часов при бб С, Полученные гранулы отфильтровывают, промывают 400 мл эфира, 400 мл ацетона и снова 400 мл эфира и затем высушивают в вакууме при 120 С. Выход составил 50 г сферических гранул диаметром 0,2 - 0,4 мм.К 50 г полученного гранулированного сополимера гмалеинового ангидрида и акриловой кислоты добавляют 40 О мл ультраконцентрата глюкоамилазы и выдерживают в течение одних суток,при постоянном перемешивании и комнатной температуре. Затем препарат иммобилизованной глюкоамилазы отфильтровывают и тщательно промывают дистиллированной водой до отрицательной реакции на белок. Полученный препарат высушивают в вакууме при комнатной температуре. Глюкоамилазная активность полученного препарата составляет 4400 в 46 ед,г сополимера. Выход по активности составляет около 32% от исходной.П р и м е р 5. 50 г сополимера малеинового ангидрида и метакрилозэй кислоты ра:твэряют в 50 мл ацетэна при постоянном перемешивании и добавляют 1,91 г 4,4.гдиаминодифенилоксида, растворенного в 10 мл дииетилформамида. Раствор сополимера при перемегцивании вливают в 2000 мл полиэтилсилоксановой жидкости. Образовавшуюся эмульсию при,перемешивании нагревают при 56 С в течение 5 часов. Полученные гранулы отфильтровывают и тщательно промывают 500 мл ацетона и 500 мл эфира и высушивают в вакууме,при 120 С, Выход составляет 50 г сферических гранул диаметром около 0,3 - 0,6 мм.К 50 г полученного сополимюра малеино(вого ангидрида и метакриловой кислоты добавляют 400 мл ультраконцентрата глюкоамилазы. Смесь выдерживают при комнатной температуре и перемешивании в течение суток. Препарат глюкоамилазы отфильтровывают и тщательно промывают дистиллированной водой до отсутствия реакции,на белок. Полу 5 10 15 20 25 Зо 35 40 45 50 ченный препарат высушивают в вакууме при ксмнатнэй температуре. Глюкоамилазная активчость полученного препарата составляет 4800 ед г сополимера. Выход по активности состазляет 56% от исходной.П р и м е р б. 50 г сополимера малеинового ангидрида и акриламида растворяют в 400 мл ацетона и добавляют 50 мл диметилформамида. В реакционную смесь при постоянном перемешивании вливают раствор 4,4- диаминодифенилоксида в диметилформамиде - 1,92 г в 10 мл и выдерживают при температуре 56 С в течение 40 мин, К реакционной смеси добавляют 2000 мл полиэтилсилоксановой жидкости. Образовавшуюся эмульсию при постоянном перемешивании выдерживают з течение 40 мин при 56 С, Полученные гранулы отфильтровывают и тщательно промывают серным эфиром (500 мл) и ацетоном (500 м,г), Затем гранулы сушат в пистолете Фишера над пятиокисью фосфора.К 50 г полученного гранулированного сополимера хгалеинового ангидрида и акриламида добавляют 800 мл ультраконцентрата глюкэамилазы. Реакцслонную смесь выдерживают в течение суток при постоянном перемешивании и комнатной температуре, Препарат иммэбилизованной глюкоамплазы отфильтровызают и тщательно промывают водой до нейтральной реакции на белок. Препарат высушивают в вакууме при комнатной температуре. Глюкоамилазная активность полученного препарата составляет 3500 в 37 ед/г сополимера. Выход по активности составляет около 60 % от исходной.П р и м е р 7, 50 г сополимера малеинового ангидрида и Х-винилппридина растворяют в 50 м,г диметилформамида при постоянном перемешивании и добавляют 1,91 г 4,4-диаминодифенилоксида, растворенного в 10 лг г диметилформамида. Раствор сополимера вливают при интенсивном перемешивании в 2000 мл полиэтилсилоксановой жидкости. Эмульсию при интенсивном перемешивании выдерживают з течение 3 часов при температуре 80 С. Гранулы сшитого сополимера отфильтровывают и промывают 5 СО мл серного эфира и 500 мл ацетона. Затем полученные сферические гранулы высушивают в вакууме при 120 С,К 50 г полученного транулированного со. полимера малеинового ангидрида и М-винилпиридина добавляют 600 мл ультраконцентрата глюкоамилазы и реакционную смесь выдерживают в течение суток при постоянном перемешивании и комнатной температуре. Препарат иммобилизованной глюкоамилазы отфильтрозывают и промывают водой до отрицательной реакции на белок. Препарат высушивают в вакууме при комнатной температуре. Глюкоамилазная активность полученного препарата составляет 3100 - 3300 ед/г сополимера, Выход по актизности составляет около 50/, от исходной.Заказ 118/217 Изд.119 Тираж 568НПО Государственного комитета Совета Министров СССРпо делам изобретений и открытийМосква, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Подписное Тип. Харьк, фил. пред. Патент П р и м е р 8. 46 г сополимера,малеинового ангидрида и Х-винилпирролидона растворяют в 50 мл диметилформамида и к раствору добавляют 4,36 г этилового эфира лизина и 7,18 г уксуснокислого натрия, растворенных в 6 л 1 л диметилформамида. Однородную массу при интенсивном перемешивании приливают к 1200 лл полиэтилсилоксановой жидкости и нагревают при температуре 75 С в течение 2 часов. Полученный сшитый сополимер отфильтровывают, промывают 500 мл ацетона, 500 мл этанола и 500 мл эфира. Полученный препарат высушивают в вакууме при 120 С,,К 50 г сополимера малеинового ангидрида и М-винилпирролидона, сшитого лизином, приливают 800 мл ультраконцентрата тлюкоамилазы и выдерживают при комнатной температуре в течение суток, Полученный препарат глюкоамилазы отфильтровывают и промывают водой до нейтральной, реакции на белок, а затем высушивают в вакууме при комнатной температуре. Глюкоамилазная активность полученного препарата глюкоамилазы составляет 6000 - 6100 ед/г сополимера, Выход по активности составляет 80 - 85% от исходной. Формула изобретения 1. Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы путем конденсации фермента с полимерной матрицей, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения активности препаратов, в качестве полимерной матрицы используют сополимеры малеинового ангидрида с гидрофильными сомономерами в сшитом виде. 2. Способ по и. 1, о тл и ч а ющи й с я темчто в качестве гидрофильного сомономера используют 1 ч-винилпирролидон.3. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем,.5 что в качестве гидрсфильного сомономера используют акриловую кислоту.4. Способ по п. 1, отличающ,яйся тем,что в качестве гидрофильного сомономера используют метакриловую кислоту.1 О 5. Способ по п, 1, отл ич аю щий с я тем,.что в качестве гидрофильного еомономераиспользуют акриламид.6. Способ по п. 1, о тл ич а ющий ся тем,что в качестве гидрофильного сомономера ис пользуют 1 ч-винилпиридин.7. Способ по пп. 1 - 6, от лича ющи й с ятем, что в качестве сшивающего агента используют 4,4-диаминодифенилоксид.8. Способ по пп. 1 - 6, отл и ч а ющий ся.20 тем, что в качестве сшивающего агента используют этиловый эфир лизина.9. Способ по пп. 7 и 8 отличающийсятем, что сшивающие агенты используют в концентрации 2 - 10 мол, %.25 1 О. Спосо,б по пп. 1 - 6, о тл ич ающий сятем, что используют сополимеры, структурированные в виде гранул или в виде армированной пленки. 30 Источники:информации, принятые во,внимание при экспертизе:1. Березин И, Н., Антонов В. К., Мартинек К. Иммобилизованные ферменты. М изд.МГУ, 1976, т, 2, с. 121, 282.35 2. Р. М. Кгагпег е 1 а 1., 1, Ро 1 упег с 1 с 1, 5 упт роз 1 пт, 1974,47, с. 77 - 87, 89 - 94.