Способ получения полирибонуклеотидов

О П И С А Н И Е и,ео 12 атИЗОБРЕТЕН ИЯ Союэ СоветскихСоциалистическихРеспублик К АВТ 0 ф СКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Дополн 1 ттельное к авт. саид-ву -Заявлено 12.05.76 (21) 2363256/2 Кл.07 Н 21/О с прис 1)еднне (23) Прйорит м заявкиГваударатвеннвй квинтет Фаветв Мнннатраа СО пе делая наааратаннн я атнрвай(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИРИБОНУКЛЕОТИЛОВ 50%.ложолири У 1 5 аИзобретение относится к усовершенствованному способу получения соединений, когорые находят широкое применение в биологии и медицине.Известны способы получения полирибон клеотидов биохимическим синтезом из риб нуклеотид-днфосфатов. Конденсацию проводят с использованием фермента полирибонуклеотидфосфорилазы (ПНФ), Источником фермента служат микроорганизмы: Мс 1 оса сив ЬводеМЬсив, АкооЬас 1 ет рте Раей,ЕЬсЬетчсЬа соРт.ИЗ и 123.К предлагаемому способу наиболее близок по технической сущности и достигаемому результдту известный способ получения 5 полирибонуклеотидов путем биохимической поликонденсации рибонуклеозид-дифосфата/ в присутствии фермента ПНФ, выделенной из Евсее сЬа соб.,По такому способу биосинтез протакает 20 при температуре около 60 С в течение 5 ч. Очистку полученного продукта реакции проводят фенолом и смесью изоамилового спирта с хлороформом (1:2,5) с последующим диализом против 0,2 М раствора хлористого иаъ, Бюллетень %13 (53) УДК 547.963.3исания 15,03,78 2рия, содержащеГо 0,001 моль ЭДТА илофилизацней целевого продукта, ВыходНедостаткамй этого способа являютсяность процесса очистки синтезированногорибонуклеотида от ферментных белков ииспользовании фенола, изоамилового спии хлороформа, а также недостаточно выский выход, поскольку часть рибонуклеоз-дифосфатов, не вступившая в реакциюбевозвратно теряется при очистке целевогопродукта. С целью упрощения процесса, а также повышения выхода целевого продукта по предлагаемому способу реакционную смесь после достижения равновесия реакции последовательно подвергают взаимодействию с гелем-М(ОЙ ),предварительно обработанным трис-НС 1 буфером, а затем с иоуообменной смолой, содержащей. группу - Х -(СНд ), для разделения целевого продукта3 и не вступивших в реакцию рибонуклеозид- -дифосфатов, которые повторно возвращают в процесс.Предлагаемый способ заключается в том, что рибонуклеозид-дифосфаты подвергаютбиохимической поиикоденсации в присутствии поиирибонукиеотидфосфорииазы, выделенной иэЬспЕ сЬа СОИ при 55-65 Си реакционную смесь посие достижения равновесия реакции посиедоватеиьно подвергаютвзаимодействию с геием ф 4 И(ОН), предваритеиьно обработанным тряс-НС 1-буфеером, а затем и ионообменнойсмопой, содержащей группу - )( -(СН)э, 22 елевой продукт выделяют ииофииизацией. 30Обычно соотношение геиьА 1 (ОН).реакционная смесь составпяет 1:1. РибоФнукиеоэид-б-дифосфаты, не вступившие вреакцию, как правило, повторно возвращаютв процесс. Суммарный выход 74%. 15Введение геня у-М(ОН) в процесс 1.в момент достижения равновесия реакцииконденсации иии накопиения фосфатов до50-60% обеспечивает стабииизацию равновесия реакции, устраняет обратный процесс 20деконденсацни с одновременной адсорбциейна поверхности геля ферментных белков,Предваритеиьная обработка геия 0,01 Мтрис-НС-буфером повышает специфическуюадсорбцнонную сйособность геля и ускоряет Ипроцесс адсорбции до 5-10 мин, Адсорбированные на геие ферментные белки удаияютцентрнфугированием,Использование ионообменной смоиы, содержащей группу - Й -(СН) позволяет 30выдеиить не вступившие в реакцию рибокнукиеоизид-дифосфаты и повторно вернутьих в процесс, что повышает выход цеиевогопродукта на 12-14%.1 аП р и м е р 1, 125 мг адеиозин- 35дифосфата (А-Дф) растворяют в 5 мпводы, к раствору прииивают 1,5 ми 1 М тряс-НС 1 (рН 8,1), 0,15 ми 0,05 М раствора,И (СН СОО),25 ед, ферментаИНФ изЕьсЬемсЬа со 0 иводудо 15 ми, Биосинтез фпроводят при 60 С. За ходом ноиимеризации,осиедят по приросту неорганического фосфата. Реакцию заканчивают через 2,5-3 час,Прирост неорганического фосфата при этомдостигает 55% - момент равновесия реакции,ф 5В реакционную смесь вводят,у-А 1(ОН) в0,01 М трис-НС 1-буфере (рН 7,5) до исчезновения фиоиетовой окраски по биурету( 1:1). Посие центрифугирования поиученныйраствор раздеияют на ионообменной смоиеАРА, эпюцию проводят 0,015 н. раствором соляной кислоты и 0,025 н. раствором,хлористого натрия. Фракцию поиннукиеотидацоспе диапиэа ииофиииэуют. фракцию А - 5ЛФ осаждают 10 объемами этилового спиртта. 3 оиучают 60 мг поии-А (52%) и 22 мгА-Дф(25%) или 12% поли-А дополнительно.12 НИИПИ 3 каэ 16374 филиал ППП фПатент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 601287Й р и м е р 2. 125 мг уридин-дифосАфата (УДф) растворяют в 5 мц водй, крастьру приливают 1,5 ми 1 М трио-НС 1 (рН 81 ),1,5 ми 0,05 М раствора Ю ф ( С НС ОО Н )125 ед, фермента ПНФ и воду до 15 мл.Биосинтез и очистку проводят в .условияхпримера 1, Получают 50% поли У и 20%У 5 Дф (или 12% поди У),П р и м е р 3. Проводят биосинтезполи-Аполиконденсацией АДф по примеру 1.йосие отцентрифугирования адсорбированногобеика на геле :А 1(ОН) .поиученный растворраздеияют на ионоабменный смоие БАК.Эиюцию А-Дф проводят 0,02 М раствором упористого натрия и 0,01 М растворомсоляной кисиоты. Фракцию поииаденозинапосие диаииза ииофииизуют, фракцию А-ДФ осаждают 10 объемами этииового спирта. Пойучают 60 мг поли-А (52%) и 22 мгА-Дф (иии 12% поли-А),П р и м е р 4. Проводятбиосинтезпоии-Упо примеру 2. После центрифугированияполученный раствор раэдеияют на ионообменной смоде 0 -1. Зиюцию У-Дф проводятовех0,2 н. раствором соияной кислоты. Фракцию поди-У посие диализа ииофииизуют,фракцию У- б -Лф осаждают. 10 объемамиэтииового спирта, Поиучают 52% поии-Уи 25% У -ДФ (иии 12% поин-У).формула изобретения1, Способ получения поиирибонукиеотидовпутем биохимической поиикоденсации рибо-нукиеоэид- дифосфатов в присутствиипоиирнбонукиеотидфосфорииазы, выделеннойизЕьсЬе кЬа соР 4 при 55-65 С, с посиедуюшей ииофииизацией готового продукта,о т и и ч а ю щ и й с я тем, что, сцепью упрощения процесса и увеиичения выхода целевого продукта, реакционную смесь поо,ле достижения равновесия реакции последова- .тельно. подвергают взаимодействию с геием.-А 1(ОН), предваритеиьно обработаннымтрис-НС 1-буфером, .а затем с ионообменнойсмоиой, содержащей группу -- .(СНй)2. Способ по п 1, о т и и ч а ю. ш и й с я тем, что соотношение гельу - А(О Й) ,реакционная смесь составляет й:13. Способ по и. 1, о. т и и ч а ющ и й с я тем что рибонукиеозид- ди 71., фосфат, не вступивший в реакцию, повторновозвращают в процесс.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе;1. Микельсон А. Химия нукиеоэидов инукиеотидов М., 1966, с. 315-323.2. Авторское саидетельство СС(;Р