Способ изготовления сибиреязвенного эритроцитарного диагностикума

И ИЕИ ЕТЕНИЯ овательскии логии и микЛ.Ф.Никоеменова М,Аантигена длятинации при968. М 10, с его изязве а готоческом равным алина, 7+0 С, еским ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬ(56) Леви М,И., Езепчук Ю.ВНПрименение протективногореакции пассивной гемагглюсибирской язве. - ЖМЭВ, 1132-134.(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ СИБИРЕЯЗВЕННОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИ КУМА(57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к способу изготовления сибиреяэвенного эритроцитарного диагностикума, и может быть использовано для диагностики сибирской язвы и дифференциальной диагностики животных, инфицированных ВасОз апйгасз, от инфицированных Изобретение,относится ( микробиологии, а именно к способу изготовления си- биреязвенногоэритроцитарногодиагностикума, и может быть использовано для диагностики сибирской язвы и дифференциальной диагностики животных, инфицированных Васцз ап)гасз, от инфицированных микроорганизмами сходной антигенной структуры,Цель изобретения - повышение активности, специфичности, стабильности целе(5)5 6 01 й ЗЗ/53, 33/556, А 61 К 3 микроорганизмами сходной антигенной структуры. Цель изобретения - повышение активности, специфичности, стабильности целевого продукта и упрощение способа его изготовления. Для сенсибилизации эритроцитов используют сибиреяэвенный антиген, выделенный из клеток В.апйгасз, в исходной концентрации 100+5 млрд/мл путем дезинтеграции их ультразвуком в течение 15-20 мин при амплитуде ультразвуковых колебаний 16-20 мкм. При этом концентрацию белка в антигене доводят до 1+0,05 мг в 1 мл, Стерилизацию антигена осуществляют путем мембранной фильтрации через фильтры МФА-МА М 4-5 типа "Владипор", Лиофилиэацию диагностикума осуществляют с использованием стабилизатора, содержащего 5+0,5% сахарозы, 3 +0,2% пептона, (у) 0,5.ф.0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,25+0,05% борной кислоты, калия фосфорнокислого однозамещенного 1,5-4,0 г/л, натрия фосфорнокислого двузамещенного 15,5-20 г/л. Способ обеспечивает высокую чувствительность, специфичность диагностикума и стабильность при хранении. 1 табл, 0,О вого продукта и упрощение способа готовления,П р и м е р 1. Изготовление сибир ного диагностикума.Из отмытых эритроцитов баран вят 12,5%-ную взвесь на физиологи растворе (рН 72-7,4) и смешивают с объемом 5%-ного раствора форм Смесь выдерживают 18-20 ч при 3 затем трижды отмывают физиологи раствором путем центрифугировани15 20 25ЗО 35 40 45 50 1500 об/мин в течение 10 мин. Из осадка готовят 2,5-ную взвесь и формалииизированные эритроциты проверяют на отсутствие спонтанной агглютинации.Затем к 2,5 ф-ной суспензии формалинизированных эритроцитов добавляют равный объем тачина. в разведения 1:10000, смесь выдерживают в водяной бане при 37 С 30 мин, Затем трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 1 500 об/мин в течение 10 мин. Танизированные эритроциты проверяют на отсутствие самоагглютинации.Для приготовления антигена 16-18-часовую культуру шт. СТИ, выращенную на мясопептонном агаре, трижды отмывают от остатков питательной среды стерильным физиологическим раствором при центрифугировании в течение 20 мин при 5000 об/мин, из отмытой культуры готовят взвесь в концентрации 100 млрд. микробных кле-. ток в 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК,Суспензию бактерий помещают в стерильный стакан ультразвукового дезинтегратора микроорганизмов, подвергают воздействию ультразвука в течение 15-20 мин при амплитуде колебаний 16-20 мкм,, Дезинтеграт микробых клеток, содержащий комплекс термолабильных и термостабильных антигенов Вас. апФгас 3, сливают в колбу и стерилизуют путем мембранной фильтрации через фильтры "Владипор" для освобождения антигена от единичных неразрушенных бактерий,Для сенсибилизации эритроцитов антиген разводят 0,15 М фосфатным буфером,рН 6,4, до концентрации 1 ч,05 мг белка в 1 мл,Для изготовления диагностикума два объема разведенного до нужной концентрации антигена смешивают с водным объемом 2,5-ной суспензии танизираванных формалинизированных эритроцитов. Смесь выдерживают 2 ч в водяной бане при 37+1 С, периодически встряхивая. Затем сенсибилизированные эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин, После последнего центрифугирования диагностикум подготавливают для лиофилизации.Для этого из осадка готовят 2,5-ную суспензию эритроцитов на стабилизаторе,В качестве стабилизатора используют раствор, содержащий 5 ч.0,5 сахарозы, 3+0,2 пептона, 0,5+О,17 ь бычьего сывороточного альбумина, 0,25 Ы,05 борной кислоты, калия фосфорнокислого однозамещенного 1,5+4 г/л, натрия фосфорнокислого двузамещенного 15,5-20 г/л (рН стабилизатора 7,2+ 0,2),Применение в качестве стабилизаторов других веществ (декстрана, галактозы, желатины, сыворотки и т.д.) не обеспечивалостабильности диагностикума. Перед лиофилизацией диагностикум суспендируют в среде высушивания (стабилизаторе), разливают в пенициллиновые флаконы или ампулы, эамораживают при(50-60)С в течение 6-18 ч, После этого материал переносят в сушильный аппарат. Сушку проводят при остаточном давлении 80-90 мкмПри загрузке температура полок должна быть не выше -20"С, температура конденсатора -40 С и ниже. В течение 14-16 ч температуру постепенно повышают до 20-25 С. Когда температура материала и полок становится одинаковой, сушку продолжают еще 4-6 ч, после этого ампулы отпаивают, а флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками, Лиофилизация препаратаобеспечивает стабильность его при хранении, Сухой диагностикум сохраняет первоначальную активность в течение 2 лет.П р и м е р 2, Изготовление сибиреязвенного диагностикума,Формалинизированные танизированные эритроциты барана сенсибилизируютсибиреязвенным антигеном, приготовленным из 16-18-часовой культуры шт, СТИ, выращенной на мясопептонном агаре, Из этой культуры готовят взвесь бактерий в концентрации 95 млрд. микробных клеток в 1 мл пооптическому стандарту мутности ГИСК идезинтегрируют ультразвуком в течение 15 мин при амплитуде колебаний 16 мкм. Деэинтеграт микробных клеток стерилизуют путем мембранной фильтрации через фильтрМ 4 МФА-МА типа "Владипор". Для сенсибилизации эритроцитов антиген разводят 0,15 М фосфатным буфером, рН 6,4, до концентрации 0,95 мг белка в 1 мл, Затем два объема разведенного до нужной концентрации антигена смешивают с одним объемом 2,5-ной суспензии формалинизированных танизированных эритроцитов. Смесь выдерживают 2 ч в водяной бане при 37 С, периодически встряхивая. Затем диагностикум трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин.Более низкие концентрации культуры(90 млрд/мл и меньше) не обеспечиваютполучения активного антигена. При снижении амплитуды ультразвуковых колебаний до 15 мкм и менее активность сибиреязвенного антигена уменьшалась независимо от времени воздействия ультразвука. При5 10 15 20 25 30 35 40 45 55 уменьшении времени обработки бактерий ультразвуком до 10 мин отмечали снижение активности антигена. Использование фильтров с меньшим размером пор (М 2-3) замедляет процесс фильтрации и приводит к снижению активности антигена. Более низкие концентрации белка не обеспечивают изготовления активного диагностикума, поэтому при исследовании положительных проб сыворотки возможно получение отрицательных результатов,П р и м е р 3. Для изготовления диагностикума формалинизированные танизированные эритроциты барана сенсибилизируют сибиреязвенным антигеном, приготовленным из 16-18-часовой культуры шт. СТИ, выращенной на мясопептонном агаре. Из этой культуры готовят взвесь бактерий в концентрации 1000 млрд, микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК и дезинтегрируют ультразвуком в течение 17 мин при амплитуде колебаний 18 мкм. Дезинтегратор микробных клеток стерилизуют путем мембранной фильтрации через фильтр М 5 МФА-МА типа "Владипор", Для сенсибилизации эритроцитов антиген разводят 0,15 М фосфатным буфером, рН 6,4, до концентрации 1 мг белка в 1 мл. Затем два объема разведенного до нужной концентрации антигена смешивают с одним объемом 2,5 о-ной суспензии формалиниэированных таниэированных эритроцитов. Смесь выдерживают 2 ч в водяной бане при 38 С, периоидчески встряхивая. Затем диагностикум трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования и ри 1500 об/мин в течение 10 мин.П р и м е р 4, Для изготовления диагностикума формалинизированные танизированные эритроциты барана сенсибилизируют сибиреязвенным антигеном, приготовленным иэ 16-18-часовой культуры шт, СТИ, выращенной на мясопептонном агаре. Из этой культуры готовят взвесь бактерий в концентрации 105 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому. стандарту мутности ГИСК и дезинтегрируют ультразвуком в течение 20 мин при амплитуде колебаний 20 мкм, Дезинтеграт микробных клеток стерилиэуют путем мембранной фильтрации через фильтр М 4 МФА-МА типа "Владипор". Для сенсибилиэации эритроцитов антиген разводят 0,15 М фосфатным буфером, рН 6,4, до концентрации 1,05 мг белка в 1 мл. Затем два объема разведенного до нужной концентрации антигена смешивают с одним обьемом 2,5 оь-ной суспензии формалинизированных танизированных эритроцитов. Смесь выдерживают в водяной бане при 37 С, периодически встряхивая, Затем диагностикум трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин.При более высоких концентрациях (110 млрд/мл и больше) повышение активности сибиреязвенного антигена не отмечают. Повышение амплитуды колебаний до 22 мкм и более не приводит к увеличению активности антигена. Увеличение времени дезинтеграции клеток до 25 мин и более не приводит к дальнейшему повышению специфической активности.Использование мембранных фильтров с большим размером пор(М 6-8) не обеспечивает стерилизации материала. Увеличение концентрации антигена нецелесообразно, так как это не приводит к повышению активности диагностикума, но увеличивает расход биологических компонентов. Кроме того. при более высокой концентрации антигена снижается специфичность реакции в результате самоагглютинации сенсибилизированн ых антигеном эритроцитов.П р и м е р 5. Диагностикум, приготовленный согласно примерам 2, 3 и 4, лиофилизируют.Для лиофилизации диагностикум суспендируют в защитной среде высушивания - стабилизаторе, В качестве стабилизатора используют раствор, содержащий 4,5 сахарозы, 2,8 пептона, 0,4 бычьего сывороточного альбумина, 0,20 борной кислоты, 1,5 г/л фосфорнокислого одноэамещенного калия, 15.5 г/л фосфорнокислого двузамещенного натрия, рН стабилизатора 7,0. Лиофилизация диагностикума в данном стабилизаторе обеспечивает стабильность его при хранении.П р и м е р 6, Диагностикум, приготовленный согласно примерам 2, 3 и 4, лиофилизируют.Для лиофилизации диагностикум суспендируют в защитной среде высушивания - стабилизаторе. В качестве стабилизатора используют раствор, содержащий 5 сахарозы, 3-",ь пептона, 0,5 бычьего сывороточного альбумина, 0,25 борной кислоты, 3 г/л фосфорнокислого однозамещенного калия, 18 г/л фосфорнокислого двузамещенного натрия, рН стабилизатора 7,2. Диагностикум, лиофилиэированный в указанном стабилизаторе, сохраняет активность и специфичность в течение 2 лет,П р и м е р 7. Диагностикум, приготовленный согласно примерам 2, 3 и 4, лиофилизируют.Для лиофилизации диагностикум суспендируют в защитной среде высушивают, содержащей 5,5 сахарозы, 3,27 ь пептона,0,6 бычьего сывороточного альбумина,1698782 0,30 борной кислоты, 4 г/л фосфорнокислого однозамещенного калия, 20 г/л фосфорнокислого двузамещенного натрия, рН стабилизатора 7,4. При использовании данного стабилизатора диагностикум сохраняет активность и специфичность.Приготовленный согласно примерам 1- 4 и лиофилизированный с предложенным стабилизатором диагностикум является активным специфичным,Результаты изучения активности и специфичности разработанного сибиреязвенного диагностикума в сравнении с прототипом представлены в таблице. Характеристика сыворотокПротивосибиреязвенная Сибиреязвенная преципитирующая Сибиреяэвенный глобулин Сыворотки вакцинированных овец (30 шт) Нормальные сыворотки овецСоставитель Г.СоболевРедактор Л.Веселовская Техред М,Моргентал Корректор С.Черни Заказ 4392 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб,. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, улГагарина, 101 Из таблицы видно, что активность предлагаемого диагностикума выше активности известного. Кроме того, предлагаемый диагностикум не взаимодействует с сыворотками здоровых нормальных) животных и гипериммуниэированных родственными микроорганизмами В.сегена ЬЬ 96 и В.апйгасо 1 без М 1312, тогда как известный диагностикум дает положительные реакции как с сыворотками вакцинированных, так и здоровых овец, а,также с гипериммунными сыворотками к В,сегеоз М 96 и В.ап 1 пгасодез М 1312,Таким образом, предлагаемый диагностикум обладает более высокой активностью. и специфичностью по сравнению с прототипом. Формула изобретения Способ изготовления сибиреязвенногозритроцитарного диагностикума, включающий получение суспензии микробных кле ток, выделение антигена, таниэацию исенсибилизацию антигеном зритроцитов барана,отличающийсятем,что,сцелью повышения активности, специфичности и стабильности целевого продукта, суспен зию получают с концентрацией 95-105млрд. микроб.кл в 1 мл, выделение антигена проводят путем обработки ультразвуком в течение 15-20 мин при амплитуде ультразвуковых колебаний 16-20 мкм, перед сенси билизацией антиген подвергают стерилизующей фильтрации и разводят до концентрации 0,95-1,05 мг/мл, а сенсибилизированные эритроциты смешивают со стабилизатором, содержащим следующие компо ненты, об,":Сахароза 4,5-5,5 Пептон 2,8-3,2 Бычий сывороточныйальбумин 0,4-0,6 25 Борная кислота 0,2-0,3Калий фосфорнокислыйоднозамещенный 0,15-0,40 Натрий фосфорнокислыйдвузамещенный 1,55-2,0 30 рН 7,0-7,4и лиофилизируют,