Способ иммунодиагностики

,1107869 1 К 39/00 ОСПО Д ПЬСТВУ ВТОРСК ВЕННОЙ НОМИТЕТ СССИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ(71) Пермский государственный медицинский институт(56) 1, Вязов О.Е., Ходжаев Ш.Х,Руководство по иммунологии. И.,1973.2. Тихонов В,А. Исследование спцифической чувствительности эритроцитов у больных туберкулезом легки(54)(57) СПОСОБ ИММУ 11 ОДИАГНОСТИКИпутем определения антигенсвязывающактивности эритроцитов, о т л и чю щ и й с я тем, что, с целью пов шения точности диагностики у каждогоконкретного больного и сокращениясроков диагностики, одновременно определяют с момента возникновения заболевания, связывание специфическогои неспецифического (контрольного)антигенов эритроцитами крови больного и здорового человека и по соотношению величин, выражающих отношениесвязывания специфического антигснаэритроцитами крови больного и связывания специфического антигена эритроцитами крови здорового человека, атакже отношение связывания неспецифического антигена эритроцитами кро-.ви больного и связываниг неспецифического антигена эритроцитами крови здорового человека, вычисляют индексспецифического связывания антигена.Заказ 5803/б Тираж б 88 ПодписноеБНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г,ужгород, ул.Проектная, 4 17 11078лы, позволяющие сравнить диагностическую эффективность исследованияпо предлагаемому способу и в РНГАу одних и тех же больных. Приняв задиагностический титр антител в РПГА1:200, положительный результат удает.ся получить у 9 из 17 больных, чтосоставляет 53 , По предлагаемому способу диагностически положительныйрезультат получен у 15 больных из 17, 1 рчто составляет 89%, т.е. на Зббольше, чем в РНГА,Особенно следует отметить эффективность исследования у больных сотрицательными результатами бактериологического исследования и у контактных лиц, По данным литературы диагностическая значимость РНГА у лиц сдиагнозом клиническая дизентерият.е. не подтвержденная бактериологическим исследованием, не превьш 1 ает14-45 . В представленном акте испыта.ния среди лиц с отрицательным результатом бактериологического анализа по.ложительная РНГА выявлена лишь у 4из 1 б обследованных, что составляет25 диагностически значимых результатов. Исследование по предлагаемому способу дало положительный результат у всех обследованных (100%), Таким образом, диагностическая эффективность способа в отношении указанной категории лиц в 4 раза выше, чемРНГА. Это очень существенный момент,поскольку именно у этой группы лицдиагностика заболевания представляет35наибольШие трудности. По существу,лишь исследование антигенсвязывающейактивности эритроцитов дает единственную информацию о наличии дизепте 40рии у большинства из указанных лиц.Проведенный анализ доказывает высокую эффективность предлагаемогоспособа в сравнении с наиболее прогрессивными методами современной ла"45бораторной диагностики инфекций,Применение принципа индивидуализации оценки специфической реакции б 9 18крови способно повысить эффективность исследования и титра антнт.л в РНГА. При обследовании группы зпоровыхлици болеющих заболеваниями не- дизентерийной этиологии установлена корреляция в титрах нормальных антител к антигенам Зонне, Флекснера и сальмоннел тифимуриум при исследовании РНГА. Коэффициент корреляции колеблются у этой группы лиц в пределах от +О,б до +1,0, Соотношение титров нормальных антител к Зонне и Флекснеру составляет в этих группах лиц в целом 1:1,2, а возможные варианты индивидуальных колебаний находятся в пределах от 2;1 до 1:4. При вычислении индекса специфического титра антител Флекснера по отношению к титру антител Зонне у больных из эпидочага дизентерии Флекснера, по данным акта испытания ОблСЭС, по средним данным всех исследований, кроме контактных лиц, величина индекса составляет 5,0, что указывает на значительный специфический уровень реакции, т.е, возрастание специфического показателя почти в. 5 раз в сопоставлении с контрольной группой. Б то же время средний титр антител Флекснера у этих лиц составляет лишь 1:212, те. у нижней границы диагностически значимого результата. У другого больного выявление антител Флекснера в титре 1:120 и Зонне 1:10 по общепринятой оценке должно быть признано пиагностически незначимым но при расчете индекса специфичности титра Флекснера по отношению к контрольной группе дает величину 11,0, что указывает на наличие высокой спе. цифической реакции и диагностически высокозначимо. Индивидуализация оценки специфической реакции крови способна повысить диагностическую эффективность исследования любого специфического показателя,Способ осуществляется следующимобразом. 1 11078 б 9 2Изобретение относится к медицине цифического антигена эритроцитами и биологии и может быть использовано крови здорового человека, вычисляют для иммунодиагностики путем выявления индекс специфического связывания анспецифической реакции крови на тигена.антиген и установления по нейприроды агента, вызвавшего заболевание.30 0,25 антигенных единиц, По стандар 55 там рассчитывают величину связывания Известен способ иммунодиагностики путем определения в реакции иммуноприлипания иммунных антител по их взаимодействию с растворимыми или корпускулярными антигенами и фиксации этих комплексов на поверхности эритроцитов 11.Однако известный способ не позволяет осуществлять диагностику в ранние сроки заболевания.Известен также способ иммунодиагностики путем определения антигенсвязывающей активности эритроцитов 1 2 1Однако известный способ недостаточно точен, поскольку при исследовании одной пробы сыворотки больного величина антигенсвязывающей актив. ности может оказаться различной изза индивидуальных различий опсонической силы крови здоровых людей. В результате диагностически значимыми признаются лишь высокие величины связывания. Кроме того, способ позволяет осуществлять диагностическое исследование не ранее 5-б дня заболевания.. Цель изобретения - повьшгение точности диагностики у каждого конкретного больного и сокращение сроков дна гн ос тик и . Указанная цель достигается тем, что согласно способу иммунодиагностики путем определения антигенсвязывающей активности эритроцитов, одновременно определяют с момента возникновения заболевания связывание специфического и неспецифического (контрольного) антигенов эритроцитами крови больного и здорового человека и по соотношению величин, выражающих отношение связывания специфического антигена эритроцитами крови больного и связывания специфического антигена эритроцитами крови здорового человека, а также отношение связывания не- специфического антигена эритроцитами крови больного и связывания неспе 10 15 20 25 35 40 45 50 У больного берут из вены кровь и стабилизируют ее антикоагулянтом. В день исследования получают свежую донорскую кровь, стабилизированную аналогичным образом. Оба образца крови одновременно центрифугируют, удаляют плазму, а эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором .хлористого натра, Делят кровь на пор. ции в соответствии с количеством антигенов, взятых для исследования. Смешивают равные объемы отмь,:ой эритроцитарной массы и раствора антигена активностью 3-4 антигенные единицы на мл, определяемой в РТПГА. Все пробьг одновременно помещают в термостат на 20-25 мин, центрифугируют и отсасывают надосадочную жидкость. Зритроциты однократно отмывают физиологическим раствором, Определяют количество связанного эритроцитами антигена по его остаточной активности в надосадочной жидкости по сравнению с исходной активностью антигена в рабочем растворе или путем непосредственного определения активности адсорбированного на эритроцитах антигена, Для определения активности антигена смешивают раствор антигена или эритроцитарную массу с равным объемом иммунной сыворотки активностью в 8-16 гемагглютинирующих единиц, определяемой в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). Смесь помещают в термостат на 1 ч и определяют гемагглютинирующую активность сыворотки по обычной схеме определения титра антител в РПГА, По уменьшению активности сыворотки в сравнении с ее рабочим титром устанавливают степень нейтрализующего действия анти- гена. Для количественной оценки связывания антигена эритроцитами готовят стандарты РТПГА с рабочим раство - ром иммунной сыворотки и с убывающими количествами антигена от 4 до антигена эритроцитами. Вычисляют ин" декс специфического связывания антигена по формуле.1107869 10 15 20 25 30 45 50 Величина связывания специФического антигена эритроцитами крови больного Индекс ССА=- Величина связывания специфического антигена эритроцитами крови здорового че- ловека У здоровых лиц и лиц контрольной группы величина индекса специфическо. го связывания антигена (ССА) не превышает 1,30. Превышение этой величины принимают за достоверный признак специфической реакции крови и соответственно оценивают ее диагностичес. кую значимость,П р и м е р 1. У двух больных острой кишечной инфекцией (2-й и 3-й день болезни) берут из вены кровь в количестве 5 мл, стабилизируют гепарином из расчета 0,02 (50 ИЕ) мл на 1 мл, Таким же образом берут в день исследования кровь донора. Пробы1 крови одновременно центрифугируют 10 мин со скоростью 1500 об/мин, отсасывают плазму (можно с поверхностным слоем лейкоцитов), а эритроцитар - ную массу трижды отмывают физиологическим раствором в объеме 1 О мл, каждый раз центрифугируя и отсасываянадосадочную жидкость. Из каждой пробы крови берут три порции эритроцитарной массы по О,б мл и помещают вцентрифужные пробирки. В каждую пробирку приливают равный объем рабочих растворов антигенов шигелл Зонне, Флекснера и сальмонелл тифимуриум, полученных из надосадочной частицентрифугатов соответствующих коммерческих бактериальных диагностикумов.Активность рабочего раствора антигеновсоставляет 3 антигенных единицы(АЕ)приопределении в РТПГА в соответствии с "Наставлением по применению эритро цитарных диагностикумов из Шигеллдизентерии и сальмонеллезных О эритроцитарных диагностикумов". Все пробирки одновременно помещают в термостат при 37 на 20 мин и периодически их встряхивают, центрифугируют15 мин со скоростью 1500 об/мин,отсасывают надосадочную жидкость,определяют в ней количесвто оставшегося антигена. Для этой цели к0,5 мл соответствующей иммунной сыворотки активностью 1 б гемагглютинирующих единиц (ГЕ) добавляют 0,5 млраствора антигена, контактировавшего Величина связывания неспецифического(контрольного) антигена эритроцитамикрови больного Величина связывания неспецифического(контрольного) антигена эритроцитамикрови здорового человека с эритроцитами, выдерживают смесь втермостате 1 ч и определяют геммагглютинирующую активность сыворотки,производя 4 последовательных разведения в 0,5 мл физиологического раствора. Добавляют по 0,25 мл соответствую.щего эритроцитарного диагностикумаи оценивают реакцию через 2,5 ч.Оценку реакции производят по общепри.нятой системе 4-х крестов. Для количественного определения антигена впробах готовят стандарты РТПГА с рабочим раствором иммунной сывороткиактивностью 1 б ГЕ и раствором антигена активностью от 4 до 0,25 ЛЕ.Каждую пробу титруют по приведеннойсхеме. Величину связывания антигенаэритроцитами вычисляют по разницемежду его исходной активностью в рабочем растворе и остаточной активностью после контакта с эритроцитами. Определив величины связываниявсех антигенов в пробах с эритроцитами крови больных и здорового чело.века, вычисляют индексы специфичес кого связывания.В табл . 1 - 3, представлены результаты исследования антигенсвязывающей активности эритроцитов кровибольных острой кишечной инфекцией.0 Представленные данные иллюстрируютособенности оценки показателя связывания и расчета индексов специфического связывания, Табл. 4 содержититоговые результаты исследования всопоставлении с данными клинико-бактериологического исследования. У обеих больных, по результатам определения антигенсвязывающей активностиэритроцитов, было сделано заключениео наличии у них дизентерии и, с учетом большей величин индекса в отношении одного из типов дизентерийныхантигенов,у первой больной предполагали наличие дизентери:. Флекснера, а 5у второй - Зонне. Представленное заключение опередило результаты бактериологического исследования соответственно на 3 и 2 дня. Особенно обращают на себя внимание данные исследо,обнаружив у этой больной ясную специфическую реакцию крови по отношениюк дизентерийным антигенам.Связывание антигена Флекснера 5 эритроцитами крови больныхх кишечной инфекцией и крови здоровогочеловека Таблица 11) Стандарты РТПГА для оценки активности антигена флекснерав реакции с поливалентной неадсорбированной иммуннойсывороткой Флекснера Разведения в физ, растворе Ингредиенты Контрольэритр. диагности-кума с физ.раствором 1:1 12 1:4 1:81:16 Сыв.+физ.р-рСыв.+4 АЕ антигена Флекс нера Сыв.+3 АЕ Сыв,+2 АЕ++ (+) Сыв.+1,5 АЕСыв.+1 АЕ(+) Сыв.+0,5 АЕСыв,+0,25 АЕ т+2) Оценка связывания антигена Флекснера эритроцитами повеличине остаточной активности антигена после контакта с эритроцитами (исходная активность антигена - 3 АЕ) в физ, растворе Разведения Ингредиентысыв.+антиген1:11:2 14 после контакта с эритроцитами 1:12 1:8 Здоровогочеловека(+) --- Осталось 2 АГ Связалось 1 АЕвания у больной С., у которой абсолютная величина связывания обоихдизентерийных антигенов по отношениюк их связыванию у здорового человекане была повышенной. Тем не менеерасчет индексов специфического связывания дал очень четкие результаты,г Количество ос1 тавшегося и свя, занного антигена7 1107869 Продолжение таблицы Ингредиенты ф сыв.+антигенРазведения в физ.растворе Количество оставшегося и связанного антигена 1:1 1:2 1:4 1:8 1:12 после контакта с эритроцитами Больной К.+ - Осталось 0,75 АЕСвязалось 2,25 АЕ Больной С. П р и м е ч а н и е: при наличии реакции двумя смежнымиконцентрациями антигена в расчет берется средняя между ними величина активности антигена. Связывание антигена Зонне эритроцитами крови больных кишечной инфекка Та блица 21) Стандарты для оценки активности антигена Зоннев РТПГА с адсорбированной иммунной сывороткой Зонне Разведения в физ. раствореКонтроль Ингредиенты( :1 3 2 1 4:8:бФ+12) Оценка связывания антигена Зонне по величине егоостаточной активности после контакта с эритроцитами(+) -- Осталось 2,5 АЕСвязалось 0,5 АЕ цией и крови здорового человеКоличествооставшегосяи связанногоантигена Осталось 2 ЛЕСвязалось 1 АЕ Осталось 2 АЕ Связалось 1 АЕ Осталось 2 АЕ Связалось 1 ЛЕ9 1107869 10 Связывание антигена сальмонелл ных кишечной инфекцией и кро": здоро тифимуриум эритроцитами крови боль- вого человека 1Таблица 31) Стандарты для оценки активности сальмонеллезногоантигена в РТПГА с неадсорбированной сельмонеллезнойсывороткой к сальмонеллам тифимуриум Ингредиенты Разведения в физ. растворе Контроль 1:1 1:2 1 4 1:8 1;16 Сыв.+физ. раствор+ Сыв. +3 АЕсальмонел. антигена(+)2) Оценка связывания сальмонеллезного антигена по величине его остаточной активности после контакта с эритроцитами (исходная активность антигена - 3 АЕ) Количество оставшегося и свя.занного антигена Разведения в физ. растворе Сыв. + антиген после контактас эритроцитамикрови 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 ЗдоровогочеловекаОсталось 1,5 АЕСвязалось 1,5 АЕ+(+) --- Осталось 2 АЕСвязалось 1 АЕ Больной К. Больной С. Индекс ССа для антигена Зонне поотношению к сальмонеллезному антиРасчет индексов специфическогосвязывания антигенов эритроцитамикрови больной К. ч" ену Сыв. +2 АЕСыв. +1 АЕСыв. +0,5 АЕСыв. + 0,25 АЕ(+) --- Связалось 0,5 АЕОсталось 2,5 АЕ1107869 12 Индекс ССА -- .-1 50,0 5 АЕ 0 5 ЛЕ1 АЕ 15 Таблица 4Результаты определения антигенсвязывающей активности.эритроцитов и клинико-бактериологического исследованияу больных кишечной инфекцией1 День болезни Величина связывания антигена эритроцитами в Е к соответствующему показателю здорового человека Клиникобактериологический диагноз Зонне Флекс- Сальмо- Зонне Флекснера нера нелл Больная.К.2-й 100 225 67 1,50 3,37 Острая дизентерия типафлекснера 2 а,средней тяжести Больная С,3-й 100 50 33 3,00 1,50 Острая дизентерия типаЗонне, среднейтяжести 45 1 АЕ 1 АЕИндекс ССА= -- : --- -=1,50.1 АЕ 1,5 АЕИндекс специфического связываниядля антФгена Флекснера по отношениюк сальмонеллезному антцгену.2 25 АЕ 1 АЕИндекс ССА: -- -3,37.1 ЛЕ 1,5 АЕРасчет индексов специфическогосвязывания антигенов эритроцитамикрови больной С. П р и м е р 2 подтверждает возможность применения предлагаемого ,способа при диагностике вирусных и риккетсиозных инфекций. П р и м е р 2. В этом варианте применения способа производят до этапа связывания антигена эритроцитами те же действия, что .и при диагности ке дизентерии. Для определения связывания.вирусного антигена к отмытым эритроцитам добавляют раствор соответствующего вирусного гемагглютинина и определяют количество связавше гося антигена по его остаточной активности в реакции гемагглютинации(РГА), проявляющейся в агглютинируюИндекс ССА для антигена Зонне по отношению к сальмонеллезному антигену1 АЕ,О 5 ЛЕИндекс ССА= в :-=3 ОО1 АЕ 1,5 АЕИндексы ССЛ для антигена Флекснера по отношению к сальмонеллезному антигену. щем действии вируса на эритроциты животных или человека.Из осадка отмытых эритроцитов крови больного и донора готовят 53-ную взвесь отмытых эритроцитов в физиологическом растворе хлористого натра. К 0,5 мл взвеси эритроцитов добавля" ют равный объем раствора геммаглютинина вируса клещевого энцефалита, разведенного боратным буфером до активности в РГА с 1 Х-ной взвесью гусиных эритроцитов до 16-32 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ). В пробу, контролирующую специфичность реакции, добавляют такой же объем раствора вируса гриппа А, разведенного физраствором до активности в РГА сТа блица 51) Гемагглютинирующая активность вируса клещевогоэнцефалита после контакта с эритроцитами кровибольной и донора Материал Разведения в физрастворе Остаточная активность,Количество связанного эритроцитами антигена 1:2 1 4 1 8 1:16 1 32 ГАЕ Исходныйрабочийрастворантигена16 Послеконтакта с эритроцитами больной 13,5 ГАЕ Послеконтакта с эри- троцитами доно 7,5 ГАЕ ра 13 110 17-ной взвесью эритроцитов человека группы 0 до 32-64 ГАЕ. Все пробы выдерживают в термостате 10 мин, центрифугируют, отсасывают надосаточную жидкость и определяют в РГА остаточную активность вирусного гемагглютинина. Для тестирования активности гемагглютинина вируса клещевого энцефалита производят последовательные двукратные разведения 0,5 мл надосадочной жидкости в 0,5 мл физраствора до 1:32. В каждую лунку добавляют по 0,25 мл 17-ной взвеси гусиных эритроцитов. В пробе с вирусом гриппа разводят материал до 1:64 и в каждую лунку добавляют по 0,25 мл 1 Х-ной взвеси эритроцитов крови человека нулевой группы. Реакцию читают через 1-2 ч после выдерживания при комнатной температуре или в термостате.Реакцию оценивают по системе четырех крестов, активность выражают в ГАЕ.При определении величины индекса специфического связывания гемагглютинина вируса клещевого энцефалита эритроцитами крови здоровых людей 7869 14было установлено, что величина нндек,са не превышает 1,20. Цифры :ндексавыше этой величины можно считать диагностически значимыми.Пример, иллюстрирующий особенности оценки специфической реакции эритроцитов в отношении вирусного анти- гена. представлен в табл, 5.Как видно из таблицы. у больной наряду с 10 усилением связывания антигена вирусаклещевого энцефалита в сравнении с соответствующим показателем донора имеет место значительное снижение связывания контрольного антигена, т.е. реакция эритроцитов носит строго специфический характер, что безусловно подтверждает наличие у больной клещевого энцефалита. Существенно, что специфическая реакция эритро. цитов выявлена в самом начале болезни.Связывание гемагглютинина вируса клещевого энцефалита и вируса гриппа эритроцитами крови больной клещевым энцефалитом и здорового человека Больная О., 3-й день болезни.15 1107869 162) Гемагглютинирующая активность вируса гриппа после контакта с эритроцитами крови Материал Разведения в физ. растворе Эста -точКоличествосвязанногоантигена ная 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 акти ность,ГЛЕ Рабочийраствор32 16 16 ГЛЕ 4,5 27,5 ГАЕУ донора+ П р и м е ч а н и е, После титра + оценивали в 0,5 ГАЕ. У больнойРасчет индекса специфического связывания антигена вируса клещевого энцефалита.13,5 16 13 5 275Индекс- - . --- 3, 1 07 5 27 5 7 5 16 ф подтверждает высокую диагностическую30 значимость исследования антигенсвязывающей активности эритроцитов у этой больной.Результаты проведенного исследования хорошо иллюстрируют преимущест ва предлагаемого способа иммунодиагностики перед известными. Действительно, у больных была выявлена специфическая реакция крови и соответственно сделано верное диагностическое заключение в такой ранний период за О болевания (2-й и 3-й дни), когда это невозможно сделать с применением известных способов иммунодиагностики, Второе преимущество способа выявляется в том, что, несмотря на большое45 количественное различие в абсолютных уровнях связывания специфического антигена у каждой больной, в обоих случаях удалось выявить индивидуально высокую специфическую реакцию 50 эритроцитов, очень близкую по показателям ее относительного прироста (индекс специфического связывания антигенов соответствующего вида шигелл - 3,37 и 3,30). При применении 55 известных критериев оценки специфической реакции по абсолютной величине связывания антигена эритроцитами у больной С. выявить специфическую реакцию крови не удалось бы.Согласно Наставлению по примене нию диагностикумов эритроцитарных из Шигелл дизентерии" Министерства здравоохранения РСФСР РПГЛ исследуют для уточнения диагноза не ранее 5-6 дня болезни. По данным испытаниям способа в городской инфекционной больнице Р 1 г.Перми, и следование крови по предлагаемому способу позволяет диагностировать дизентерию не позднее 2 дня болезни, т.е. на 3-4 дня раньше, чем это возможно при постановке РПГА.Эффективность предлагаемого способа особенно значительна в первую неделю заболевания дизентерией. По паиным акта испытания в периоп с 2 по 7 пни заболевания положительное диагностическое заключение было получено у 12 из 14 обследованных больных (85,7 Е). По данным литературы на пер" вои неделе заболевания дизентерией антитела обнаруживаются в РПГА в диагностическом титре лишь у 107. больных. Следовательно, ца первой неделе заболевания предлагаемый способ в восемь раз эффективнее РПГА.Он эффективнее РПГА и в относительно поздние сроки заболевания, когда происходит накопление в крови достаточного количества иммунных антител. В акте испытания, представленном Пермской ОблСЭС, содержатся материа.