Фрагмент нуклеиновой кислоты зонд для выявления и идентификации флавивирусов, переносимых комарами

ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ТЕЛЬСТВ ститут биоорН СССР,Злобин048) (088.8) Этот фрагмент длятификации Э 1 М скон ве анализа извест последовательност да эталонных флавв районе гена бел сервативный для в иренна осноявлен струирова ных нукле ей геномо ных ля ря и это ивирусов.ка пЯ вья н кон ех расши рованных СУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ О ИЗОВ ЕТЕНИЯМ И ОТБЫТИЯМПРИ ЮНТ СССР(71) Новосибирский инганической химии СО А(54) ФРАГМЕНТ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТЗОНг 1 ЧЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИФЛАВИВИРУСОВ(57) Изобретение относится к биотехнологии, к полуцению генно-инженерным путем эффективных зондов. используемых в эпидемиологии и вирусологии.для выявления и идентификации Изобретение относится к биотехнологии, а именно к фрагментам нуклеиновых кислот (НК), и может быть использовано в эпидемиологии, вирусологии для выявления и идентификации вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), . вируса Западного Нила (ВЗН), вируса энцефалита долины Мюррей (ЭЦМ) и вируса э ,цефалита Сен-Луи (ЭСЛ),Созданы простые и безопасные в полуцении, воспроизводимые по результатам тестирования зонды для выявле" ния и идентификации ВКЭ, ВЗН, ЭЦМ и ЭСЛ, которые знацительно облегчают задацу по получению коммерчески: тест-наборов для выявления и идентификации фла вивирусов. флавивирусов, Предложены простые й безопасные в получении наборы фрагментов нуклеиновых кислот длиной в 18 нуклеотидов, отличающихся один от другого точечными заменами, соответствующими точечным заменам в консер, вативномм районе белка пЯ 1 хара ктерными для определенного вируса, Эти фрагменты НК имеют следующие последовательностити:5 -ЛССАССТТССССАССАССАдля вируса клещевого энцефалита,,5 -ЙССААСТТСТССАССАССАдля вируса Западного Нила,5-дсСАССТССТАСААСАССА для вируса .энцефалита долины Мюррей;5-ОАСАССТССТССААСАССАдля вируса энцефалита Сен-Луи, 3 табл,Фрагмент НК представляет собой дезоксиолигонуклеотид длиной 18 звеньев, который синтезируют химическим методом с использованием в качестве исходных компонентов модифицированных (защищенных) дезоксиолигонуклеотидов. Фрагмент НК имеет следующую, нуклеотидную последовательность: 5 - ЙССАССТССТАСААСАССА з 16788Флавивирусов участок, состоящий иэ18 нуклеотидов, который у любых двухФлавивирусов отличается не менее,чем двумя точечными нуклеотиднымизаменами, и имеет следующую нуклео 5тидную последовательность у разныхвирусов:ВКЭ (5"-3 ) цССцССцССССААССцСС;,ЭСЛ ЦССЦСЦЦССАСЯАССЦСЦ;где подчеркнуты позиции, отличающиеся от последовательности вируса клещевого энцефалита. Наличие точечныхзамен на выявленном участке обеспечивает высокую специфичность полученного зонда, комплементарного выявленной последовательности,Все эти Фрагменты родственны по 20нуклеотидному составу и отличаютсяодин от другого несколькими точечными заменами, позволяющими достаточно точно идентифицировать вирус пригибридизации, 25Синтезированные Фосфитамидным методом предлагаемые Фрагменты нуклеиновых кислот испытаны с целью определения возможности их использования,в качестве зондов для выявления и .идентификации как отдельных флавивирусов, так и Флавивирусов, переноси"ф. мых комарами. Цля испытаний используют штаммы вирусов, полученные изГосударственной коллекции вирусовИнститута вирусологии им. Д,И.Ивановского и, следовательно, отличныеот эталонных, полученных за рубежом.Все испытанные Фрагменты позволяютвыявлять и идентифицировать соответствующиее вирусы. П р й и е р 1. Синтез дезоксиолигонуклеотидов - фрагментов НК.НК синтезируют в количестве 1-10оптических единиц на автоматическомсинтезаторе Фосфитамидным методом,используя в качестве мономеров 5-О-диметокситритил-Ю-ацил-(Р-метилдиизопропиламид)фосфаты нуклеозидовчистоту полученных НК проверяют электрофореэом в 20-ном денатурируюшемполиакриламидном геле. Все синтезированные Фрагменты НК были не менее80-ной чистоты Структуру синтезированных Фрагментов подтверждают ана,лизом по Максаму-Гилберту,П р и м е р 2, Испытание полуценных Фрагментов в качестве зондов 35 для выявления и идентификации флавивирусов.Вирусы, В работе используют вирусы, полученные иэ Государственнойколлекции вирусов при Институте вирусологии им, Д,И,Ивановского, В ка-.честве вирусного материала используют мозг зараженных мышей, белых беспородных мышей массой 6 - 8 г заражают в мозг 0,03 мл вируссодержащей суспензии,содержащей около 6,0 1 р ЛД Животных забивают при появлении клинических симптомов заболевания на 1-7 сут от момента заражения. Мозг препарируют и хранят при -10 фС. Вкачестве образцов для анализа берут суммарную РНК мозгаВыделение суммарной РНК мозга. Суммарную РНК выделяют экстракциейгорячим кислым Фенолом (60 С, рН 5,2) в присутствии додецилсульфата натрия(5,0-1,0 мас,/объем) с последующим спиртовым осаждением, Осадок РНК собирают центрифугированием 30 мин при 6000 об/мин, Осадок растворяют в 7,54-ном Формальдегиде - 10 мМ Фосфата натрия,рН 7,0, и определяют концентрацию РНК спектрофотометрически, принимая 1 о.е, Ао=10 мкг РНК:Иммобилизация РНК на нитроцеллюлоэных Фильтрах, РНК денатурируют прогревом в 7,54-ном растворе Фор" мальдегида 15 мин при 56 С, эате;.: добавляют раствор 20 цБЯС (3,0 М натрий хлорид - 03 М натрий цйтрат рН 7,0) до концентрации 10 г ЯБС и образцы РНК наносят на нитроцеллюлозные Фильтры. Фильтры сушат при комнатной температуре 15-30 мин, а затем в вакуумном сушильном шкафу 12 ч. при 80 С,Мечение олигонуклеотидов. Слигонуклеотиды метят с помощью полинуклеотидкиназы Т в присутствии- Р-Дтф (1000 Ки/ммоль) до удельной активности 500-1000 Ки/ммоль олигонуклеотида.Гибридизация. Нитроцеллалозные Фильтры с иммобилизованными препаратами РНК инкубируют в гибридизационной смеси состава: 6 ю ЗЯС, 2,5 х раствор Денхарта, 054 (масса/объем) ,додецилсульфат натрия, 200 мкг/мл денатурированной и Фрагментированной ДНК быка при 65 С в течение 1 ч. Затеи добавляют фР-меченый олигонуклеотид (0,2-0,5 пмоль/мл) и гибрири) Д 7 Обозначение Вирус ВКЭ ОГЛ Киасанурская леснаяболезньНегиши Нег ЛангатПовассан Лан Пов Шотпа нд" ки й э н цефаломиелит овец ШЭО Вирус ЗападногоНила ВЗН Энцефалит долиныМюррей зуют 6-18 ч при 5"-;. Радиоа ктивность, связавшуюся с фильтрами, выявляют радиоавтографией на рентгеновскую пленку с усиливающим экраном или просчетом радиоактивности на жидкостном сцинтилляционном счетчике,Положительными принимались сигналы превышающие уровень фона отрицательного контроля в 2-3 раза,В табл, приведены флавивирусы, использованные в экспериментах по гибридизации, Результаты представ,лены в табл,2, Как видно из резуль-. татов., зонд, комплементарный геномной РНК ВКЭ, реагирует в наибольшей степени с вирусом клещевого энцефалита штамм Софьин, Реакция зонда с другими вирусами незначительна и не превышает 5,9 (вирус Негиши) о 1 , ровня оеа кции с гомологичным вирусе м, Аналогичная высокая специфичность была получена для других зондов: 3 Б -33, который реагировал преимущественно с ВЗН, ЗЦМ, который реагирс вал преимущественно с вирусом доли.",. Мюррей, СЛЕкоторый реагировал преимущественно с вирусом Р.;:пользование предлагаемого Фрагмента нуклеиновых кислот для выяв:,;-: Идентифи ка ции ВКЭ обес печи- в:;ат следующие преимущества: имею:. еся в настоящее время автоматическ:е синтезаторы опигонуклеотидов позяю-. просто и быстро получать лю-. бые Фрагменты НК длиной до 30-70 нуклеотидов, при получении зонда исключается работа с вирусами, ооеспечизается возможность получения зон дов практически в любых необходимых . количествах, в отличие от моноклональ ных антител возможен контроль зонда путем проверки его химической структуры в Отличи 8 От моноклональных антител возможно прогнозирование специфичности зонда, появляется возможность решения задачи по получению коммерческих тест в набор для выявления и идентификации большого числа Фла.". ч ви русов. Высокую воспроизводимость предлагаемого м 8 тода иллюстрируют данные табл 3, где представлены результаты повторных экспериментов с двумя прела ратами зонда, Оба препа рата высоко специс:., о реагируют с ВКЭ с близки; " нем Гибридизации (3758 и.)1и мп/ ,. ;м итах соответс . ванно), уров 1 нь гиоридизации с другими вирусами варьировал незначительно и не превышал 5 9и 6,64 (вирус Негиш, ) в первом ивтором опытах относительно э 1 алонного штамма ВКЭ,Формула изобретения фрагмент нуклеиновых кислот зонд для вьявления и идентификацииФлавивирусов размером 18 нуклеотидов,кодирующих консервативный участок белка ОБ флавивирусов, синтезированный химически с использованием в качестве мономеров модифицированных защищенных дезоксинуклеозидов, со следующими нуклеотидными последовательностями."5-йССАССТТССССАССАССАдля вирусаклещевого энцефалита;5 ЛССААСТТСТССАССАССАдля вирусаЗападного Нила.5-аССАССТССТАСААСАЖСАдля вирусаэнцефалита долины Мюррей,"5 -йАСАССТССТССААСАССАдля вирусаэнцефалита Сен-Луи.Т а б л и ц а Комплекс клещевого энцефалита Вирус клещевого энцеФалита, штаммСофьин Омская геморрагическая лихорадка Подгруппа японского энцефалита678835 Продолжение табл,нцефалит Сен СЛ 5 Конт рол ь Вирус японскогоэнцефалита Уровень гибридизации упроцентах относительно ВК"Контроль - РНК нормаль 1 О ,мыши. ан в ВЯ мозг группа Денге,Витаус Денге 2щ щ щф 1 ттщщ ут щ щ щщщщДен аблиц ибридизация, имп/минФ), по опыту Вирус1 Виру О) ВКЭООГЛ ОГО ЭНЦЕфаЛИТ100 2,0 омплекс КЭ ГЛ ЛБ К 1 5 Нег25ЛанЛаПоШЭО По онтольф" 33 (0,9)щ т 5 2 (1; тттттлицеЛЕ ЯЭ бридизац радиоакт нтах отн нтролья приведена ввности (имп/мисительно ВКЭ,РНК нормально уппа Денге Составитель Б.КузнецовТехред Л,Олийнык Корр ек Редактор Н. Козл евс кая Подписно ГКНТ СС бретениям и открытиямаущская наб., д. 4/5 льский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гаг роизводственнодгруппа японского энцефалит За каз 3990 Тираж ВНИИПИ Государственного комитета по и 113035, Москва, Ж, ФГ стве 5 ММК мыши