Способ определения молочной кислоты

ОЮЗ СОВЕТСКИХОЦИАЛИСТИЧЕСКИЕСПУБЛИК 1655 201 И РЕТ ЕЛЬСТВУ. налет смываюрН 7,2 - 7,4),фатным буфегированием и На мембрануной частью вверхсят 50 мкл смеси, сфосфатного буфера17,5-ного бычьегмина и 100 мг влажаассы клеток.распределяют по и ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ И К АВТОРСКОМУ СВИ(71) Днепропетровский медицинский институт и Днепропетровский государствекныйуниверситет им, 300-летия воссоединенияУкраины с Россией:асхате зепзог атЬ ввоЬеб епгуве Фогцзе и ччо ицбез ьч 11 Ь епбосгпе агйсарапсгеаз. - Сиса СЬевзажгу, 1985. ч;31,М 3, р. 451 - 453.Абавочс Е., Вцгыеп С.-асхатеепгуве ееМгобе, оЬапеб аФ ввоЬФаебгезргасогу сЬаи 1 гов ЕзсЬегсЬа со апбохудеп ргоЬе аког зресйс бетегвпатоп о(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛОЧЙОЙКИСЛОТЫ Изобретение относится к медицине, а именно к методам определения метаболитов с помощью ферментных.электродов.Целью изобретения является повышение чувствительности способа.Способ осуществляют следующим образом.Культуру Аегососсцз чгбапз (коллекция ВНИИА, 1988, 167 чВ) выращивают на твердой питательной среде, содержащей 50 - 100 мкг 01:лактата лития, 30 - 50 мкг грамурина и 2 - 5 мкг этония на 1 мл среды при 32 - 38 ЫС в течение 36 - 48 ч, Выросший(57) Изобретение относится к медицине, а именно к методам определения метаболитов с помощью ферментных электродов. Цель изобретения - повышение чувствительности. Способзаключается в том, что в качестве ферментного сенсора используют кислородный электрод с иммобилизованными клетками аэрококков Аегососсцз чгдапз ВНИИА 1688(167 чй) с повышенной способностью окисления молочной кислоты, Скорость поглощения кислорода дополнительно усиливается с помощью введения в реакционную смесь 0,1 М О- -а-аланина, Объем анализируемой пробы 20 мкл, чувствительность. способа 0,1 мкМ, время формирования сигнала 2,9 - 4,1 с, время возвращения сигнала на базовый уровень при отмывке электрода от метаболитов 3 - 5 с, интервал линейности калибровочного графика 0,5 - 5 мкм. Электрод стабилен в течение 2 мес при хранении при 4 С, 2 табл.1 ил. т 0,01 М фосфатным буферомотмывают дважды 0,01 М фосром (рН 7,2 - 7,4) с центрифури 3000 об/мин. перевернутого сенсор- электрода Кларка наноостоящей иэ 2,7 мл 0,1 М (рН 6,6 - 6,8), 1,5 мл о сывороточного альбу- ного веса отлитой биоСмесь равномерно оверхности мембраны.Добавляют 10 мкл 10;6-ного глутарового альдегида с быстрым распределениемего по поверхности мембраны стекляннойпалочкой,Электрод инкубируют в перевернутомсостоянии при +4 С в течение 8 ч, после чегоферментный слой накрывают диализноймембраной; Электрод помещают сенсорнойчастью в 0,01 М фосфатный буфер (рН 7,2 -7,4),Для определения концентрации молочной кислоты в биологическом образце вмикроячейку вносят 20 мкл смеси, состоящей из 10 мкл биологического образца и 10мкл 0,1 М раствора 01: а-аланина.Сенсорную часть электрода вводят вМикроячейку и производят регистрациюскорости поглощения 02, выражаемой в нМпоглощенного 02 в 1 мин. Производят расет концентрации молочной кислоты в обаэце согласно калибровочной кривойависимости скорости поглощения 02 приркислении О:лактата лития в определенйых концентрациях.В табл.1 приведены данные по скоростиокисления О и :стереоизомеров молочнойкислоты в присутствии 0,1 М О: а-аланинаи без него.На чертеже приведен пример калибровочного графика. Интервал линейности составляет 0,5 -5,0 мкМ лактата.В табл.2 показано стимулирующее действие предельных и оптимальных концентраций 0 - . а -аланина на окислениеИ:лактата.П р и м е р 1. Культуру Аегососсцзу гЫапз 167 ЧВ (коллекция ВНИИА, В 1688). выращивают на твердой питательной среде,одержащей 50 мкг/мл РЕ-лактата лития,0 мкг/мл грамурина и 2 мкг/м этония, при32 С в течение 36 ч. Выросший налет смыфают 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,2 -7,4), отмывают дважды 0,01 М фосфатнымбуфером (рН 7,2 - 7,4) центрифугированиемпри 3000 об/мин в течение 15 мин,На мембрану перевернутого сенсорнойЧастью вверх электрода наносят 50 мкл смеси, состоящей из 2,7 мл 0,1 М фосфатногобуфера (рН 6,8) и 1,5 мл 17,5-ного бычьегосывороточного альбумина и 100 мг влажного веса отмытой биомассы клеток.Смесь равномерно распределяют по поверхности мембраны стеклянной палочкой,Добавляют 10 мкл 10-ного глутарового альдегида с быстрым распределениемего по поверхности мембраны стекляннойпалочкой.Электрод инкубируют в перевернутомсостоянии при+4 С в течение 8 ч, после чегоферментный слой накрывают диализной мембраной, Электрод помещают сенсорной частью в 0,01 М фосфатный буфер (рН 7,2 -7,4). Для определения концентрации молочной кислоты в биологическом образце в микроячейку вносят 20 мкл смеси. состоящей из 10 мкл биологического образца и 10 мкл 0,05 М раствора 0: а -аланина.10 Сенсорную часть электрода Кларка вводят в микроячейку и производят регистрацию скорости поглощения 2, выраженной в нМ поглощенного 02 в 1 мин, Производят расчет концентрации молочной кислоты в образце согласно калибровочной кривой зависимости поглощения 02 при окислении 01-ла ктата. 15 П р и м е р.2, Культуру Аегососсцзчгйапз 167 Чй (коллекция ВНИИА, М 1688) 20 выращивают на твердой питательной среде,содержащей 50 мкг/мл О -лактата лития,30 мкг/мл грамурина и 2 мкг/мл этония,буфером (рН 7,2 - 7,4) с центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин.На мембрану перевернутого сенсорной частью вверх электрода наносят 5 мкл смеси, состоящей из 2,7 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,8) и 1,5 мл 17,5 ф-ного бычьего сывороточного альбумина и 160 мл влажного веса отмытой биомассы клеток 30 35 Аегососсцз ч 1 гдапз 167 Чй (коллекция ВНИИА, М 1688). Смесь равномерно распределяют по поверхности мембраны стеклянной палочкой,Добавляют 1 мкл 10;-ного глутарового альдегида с быстрым распределением его по поверхности, мембраны стеклянной палочкой. 40 Электрод инкубируют в перевернутомсостоянии при+4 С в течение 8 ч, после чего ферментный слой накрывают диализной мембраной. Электрод помещают сенсорнойчастью в 0,01 М фосфатный буфер (рН 7,2 -7,4). Для определения концентрации молочной кислоты в биологическом образце в микроячейку вносят 20 мкл смеси, состоящей из 10 мкл биологического образца и 10 мкл 50 0,1 М раствора 03- а-аланина. Сенсорную часть электрода Кларка вводят в микроячейку и производят регистрацию скорости поглощения 02, выражаемой в нМ поглощенного 02 в 1 мин. Производят расчет концентрации молочной кислоты в образце согласно калибровочной кривой 55 при 32 С течение 36 ч. Выросший налет25 смывают 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,2 - 7,4), отмывают дважды 0,01 М фосфатным1655988 Та блица 1 Поглощение 02 нМ за 1 мин, при окислении разных иэомеров лактата.Концентрация : молочной КИСЛОТЫмкМ ь(+) оьнокд Без добавок Алании 01 М Без доба Алании О, М Без добавок Алании О, 1 М 98,5-13517318 120.8 140.13,122 О.О,Б25321 105,6-17, Э 171,323,2 110.11,2 201-23,2 231. 4,5 560-34,2 640 7 18 8оо зависимости скорости поглощения 02 при окислении О -лактата.П р и м е р 3. Культуру Аегососсцз чгОап 8 167 ЧК(коллекция ВНИИА, % 1688) выращивают на твердой питательной среде, содержащей 50 мкг/мл О -лактата лития, 30 мкг/мл грамурина и 2 мкг/мл этония при 32 С в течение 36 ч, Выросший налет смывают 0,01 М фосфатным буфером(рН 7;2 - 7,4), отмывают дважды 0,01 М фосфатным буфером (рН - 7,4) с центрифугированием при 3000 рб/мин в течение 15 мин.На мембрану перевернутого сенсорной частью вверх элетрода наносят 5 мкл смеси, состоящей из 2,7 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,8) и 17-ного бычьего сывороточного альбумина и 100 мл влажного веса отлитой биомассы клеток Аегососсцз ч 1 гМапз 167 ЧВ, Смесь равномерно распределяют по поверхности мембраны стеклянной палочкой.Добавляют 10 мкл 10;6-ного глутарового альдегида с быстрым распределением его на поверхности мембраны стеклянной палочкой.Электрод инкубируют в перевернутом состоянии при+4 С в течение 8 ч, после чего ферментный слой накрывают диализной мембраной, Электрод помещают сенсорной частью в 0,01 М фосфатный буфер (рН 7,2 - 7,4).Для определения концентрации молочной кислоты в биологическом образце в микроячейку вносят 20 мкл смеси, состоящей из 10 мкл биологического образца и 10 мкл 0,15 М раствора О 1 - а-аланина,Сенсорную часть электрода Кларка вво дят в микроячейку и производят регистрацию скорости поглощения 02, выражаемой в нМ поглощенного 02 в 1 мин. Производят расчет концентрации молочной кислоты в образце согласно калибровочной кривой за висимости скорости поглощения 02 приокислении 1:лактата.Время формирования сигнала составляет 2,9 - 4,1 с, время возвращения сигнала на базовый уровень при отмывке электрода 15 от метаболитов 3 - 5 с. Электрод можетхраниться до 2 мес при 4 оС. Фо р мул а и зоб рете н и я Способ определения молочной кисло ты, заключающийся в регистрации поглощения кислородапри окислении анализируемой смеси, содержащей молочную кислоту, иммобилизованным ферментным реагентом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, 25 что, с целью повышения чувствительности,в качестве ферментного реагента используют клетки Аегососсцз Югагапэ ВНИИА, 1688, окисляющие О- и -изомеры молочной кислоты, а в анализируемую смесь добавля ют равный объем 0,05 - 0,15 М раствора О- а-аланина,1655988 Таблиц а 2 О,О 5 Поглощение 05, нМ за 1 мин,. при окислении ВЬ-лактата привведении в систему ЭЬ-о(-аланина в концентрации, М Концентрациимолочной кислоты, мкМ О, 15 0,1 140-135 1 220 10,8 253 21 145 755 12510,2193,2.8,7210-. 2 э 5340,8 ф 5 6531 12,7 985 5-13 ъ 517318201 1758 210,8 ф 11,2223,5 Ф 9,5 0,5 1,0 499,811,2591+18, 8 499 ь 9-205759320,3 317,8 ф 23502,321,2 5,0 10,0 та оставитель А, Семеновехред М,Моргентал Корректор С. Шевку дактор Т. Лазорен Тиражвенного ко113035, М аказ 20 371 Подписноемитета по изобретениям и открытиям при ГКН ква, Ж, Раушская наб., 4/5 ПИ Госуда роизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101