Способ определения морозоустойчивости сортов озимой пшеницы

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН вел О 3 4 Р ОЮ СОЮЗ СОВЕТСКИХСОПИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУВЯИКГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕведомство сссР ттоспАтент сссРт К АВТОРСКОМУ СВ ЕТЕЛЬСТВ(71) Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО АН СССР(и) спосОБ ОпРеделения мОРОЗОустойчивости соРтОВ озимой пшеницы . (57) Изобретение относится к физиологии растений и может быть использовано при диагностике на холодоустойчивость больших наборов сортов и генотипов озимой пшеницы для целей селекции. Цепь - снижение трудоемкости, повышение надежности определения и его ускорение. Проращивают семена исследуемых сортов, Получают белковые экстракты из проростков и осуществляют постановку иммунотеста полученного белкового экстракта с сывороткой на белки морозоустойчивого сорта. В качестве иммунотеста используют реакцию двойной пю Ж Оц 16 Ш 062.Ь 1(ЯЦ 5 61 7 66 иммунодиффузии через барьер с применением трех сывороток две из которых - проявляющиеся на белки проростков высокоморозоустойчивого сорта озимой пшеницы стрессированных при отрицательной температуре, и белки одномесячных активновегетирующих растений, и одна барьерная - на белки проростков низкоморозоустойчивого сорта. Оценку осуществляют по отношению количества белка, при котором происходит взаимодействие белкового экстракта через барьерную сыворотку с проявляющей сывороткой на белки активновегетирующих растений, к количеству белка при котором происходит взаимодействие белкового экстракта через барьерную сыворотку котором происходит взаимодействие белкового экстракта через барьерную сыворотку с проявляющейся на белки пшеницы высокоморозоустойчивого сорта, при этом чем выше величина отношения, тем более морозоустойчив сорт, 1 ил.20 30 Изобретение относится к физиологии растений и может быть использовано при диагностике на холодоустойчивость больших наборов сортов и генотипов озимой пшеницы для целей селекции.Цель изобретения - снижение трудоемкости, повышение надежности определения и его ускорение,На чертеже представлена схема пост- новки двойной иммунодиффузии через барьер,где 1 - раствор белка;2 - барьерная сыворотка; 3 - проявляющая сыворотка; 4 - линии преципитации белков, прореагировавших с барьерной сывороткой; 5 - линия преципитации антигена, прореагировавшего с проявляющей сывороткой,Способ основан на том, что в качестве маркеров используют антигены, по содержанию которых в белке судят о степени мороэоустойчивости сорта озимой пшеницы,В качестве таких маркеров используют два количественно преобладающих энтигена. Высокое содержание первого характерно для высокомороэоустойчивых генотипов растений, второго- для ниэкоморозоустойчивых генотипов. Первый антиген проявляется сывороткой на белки проростков растений высокоморозоустойчивых генотипов озимой пшеницы (в процессе роста содержание его в растении снижается) и содержание его еще более увеличивается под действием низкой температуры, поэтому для его проявления используется сыворотка на белки трехсуточных проростков пшеницы сорта Альбидум 24, подвергнутых холодовому воздействиюОС в течение 1 ч. Второй энтиген проявляется сывороткой на белки активновегетирующих одномесячных растений, поскольку содержание этого энтигена исходно низкое, в процессе роста и развития растения постоянно увеличивается и к этому возрасту достигает высокого уровня, поэтому для его проявления используется сыворотка на белки одномесячных растений пшенично-пырейного гибрида ППГ 829.Для выявления этих антигенов.маркеров используют метод двойной иммунодиффузии через барьер, Принцип метода иммунодиффузии через барьер состоит в том, что белок, внесенный в лунку в слое агара в виде рзствора, диффундирует в агаре и реагирует с диффундирующей из двух лунок барьерной сывороткой, В качестве барьерной сыворотки используют сыворотку нэ белки проростков ниэкоморозоустойчивого сорта, поскольку зтз сыворотка имеет низкий титр антител нэ оба этих анти- гена (вкачестве барьерной сыворотки используют сыворотку на белки трехсуточных проростков пшеницы сорта Скала). При реакции белка с барьерной сывороткой выпадают в преципитат все остальные антигены, имеющиеся в суммарном белке, и часть антигенов, но часть этих двух антигенов в результате истощения барьерной сыворотки пробивает барьер. По другую сторону барьера находится лунка с проявляющей сывороткой (сывороткой на белки пшеницы сорта Альбидум 24 для первого антигена и белки ППГ 829 для второго антигена). Пробившие барьер антигены преципитируют с проявляющей сывороткой, в результате чего образуется ясно видимая опалесцирующая линия преципитзции,Сущность предложенного способа состоит в том, что для определения мороэоустойчивости проводят одновременную диффузию ряда разведений исходного белкового раствора. При этом отмечают последнее разведение белкового раствора, на котором интересующий нас антиген пробивает барьер и реагирует с проявляющей сывороткой, Предварительно определяют содержание белка в исходном белковом растворе и после проведения диффузии рассчитывзют количество белка в лунке с отмеченным разведением. Одновременно проводят диффузию двух партий постановок иммунодиффузии: в первой партии проявляющей сывороткой является сыворотка нз белки пшеницы сорта Альбидум 24 и определяется первый знтиген, во второй - сыворотка на белки ППГ 829 и определяется второй антиген,При определении морозоустойчивости берут отношение содержания первого анти- гена к содержанию второго, Для этого количество белка (в мкг) в лунке, в которой происходит последний пробой антигена, проявляемого сывороткой на белки ППГ 829, делят на количество белка в лунке, в которой происходит последний пробой антигена, проявляемого сывороткой на белки пшеницы сорта Альбидум 24, Полученную для исследуемого сорта величину сравнивают с величиной, определенной при анализе контрольного сорта с известной зимостойкостью,Сопоставительный анализ с известным способом показывает, что способ определения морозоустойчивости растений отличается от известных тем, что он не требует сложных и дорогостоящих приборов и позволяет проводить анализы в необходимом для статистической достоверности числе повторностей,Способ осуществляется следующим образом, 1607087лунки для проявляющей сыворотки - по 75 мкл проявляющей сыворотки, а в лунки для белка - по 50 мкл раствора белка (с разведениями от исходного до 1;7), Стеклянные 40 В работе используют этиолированные проростки озимой пшеницы. Растительный . материал выращивают на влажной фильтроввльной бумаге в термостате при 28 С в течение 3 сут. Побеги пшеницы измельчают 5 в ступке с жидким азотом и белки экстрагируют одним объемом 0,15 М Ма С в фосфатном буфере 0,1 М (рН 7,4), содержащего 0,01 М меркаптоэтанола. Структурные элементы клеток осаждают центрифугированием при 20000 О в течение 15 мин. Высокомолекулярные соединения из супернатанта, используемые в дальнейшей работе, отделяют от ниэкомолекулярных на колонке с сефадексом Ги лиофильно высушивают. Белковые препараты, полученные из растений сортов Скала, Альбидум 24 и ППГ 829, используют для получения сывороток. С этой целью антигены смешивают с дополнителем Фрейнда и подкожно вводят кроликам, В первом цикле (три приема с недельными интервалами) вводят по 75 мг белка, а при реиммунизвции через месяц - по 40 мг бел, ка. Череа 10 дней после реиммунизвции бе. 25 рут кровь из краевой ушной вены, отделяют сыворотку, высэливают гамма глобулино вую фракцию сульфатом аммония (0,ф насыщения), концентрируют и растворяют в0,15 М ИаС 1. Измерение содержания антигенов проводят методом двойной иммунодиффуэии через барьер. Для этого на стеклянной пластинке размером 6 х 9 см наносят слой расплавленного агара, приготовленного на 0,15 М Мво, В застывшем слое агара с помощью трафарета пробиваются лунки согласно схеме чертежа. 8 лунке для создания барьера с помощью дозвтора вносят по 75 мкл барьерной сыворотки, в пластинки помещают в чашки Петри и ставят в холодильник на 2 - Э сут для прохождения иммунодиффузии. Содержание белкав исходном белковом растворе предварительно определяют по методу Лоури, Послеокончания иммунодиффузии рассчитываегся количество белка в лунке для разведений,на которых произошел последний пробойбарьера каждым из антигенов и рассчитывается отношение пробоя антигена, проявляемого сывороткой на белки ППГ 829, кпробою внтигена, проявляемого сывороткой на белки пшеницы Альбидум 24. Полученйая для исследуемого генотипавеличина сравнивается с величиной. полученной для сорта с известной морозоустойчивостью, взятого за эталон (в данномслучае сорта Безоствя), Чем выше у исследуемого генотипа эта величина, тем более морозоустойчив этот генотип (см. таблицу).Сравнение высокомороэоустойчивыхгенотипов 155 и 160 и низкоморозоустойчивых генотипов 172, 157, 51 со среднеморозоустойчивым сортом Безостая, взятым заэталон.Наиболее холодоустойчивый генотип -155, зв ним следуют 160. Безостая - эталонный сорт, 51, 172 и 158,Техническое решение обеспечивает выявление белков-маркеров, обусловливающих устойчивость растений к ниакимтемпературам.йзмерениесодержаниязтихбелков може быть использовано при диагностике большого числа сортов и гибридовозимой пшеницы для селекции на морозостойкость. Использование способа на се.лекционных станциях дает воэможностьсократить сроки и повысить надежность селекции сортов озимой пшеницы.(56) Авторское свщетельство СССРЬ 1494884, кл. А 01 6 7 ЮО, 1987.1601087 Формула изобретения Составитель Е, ШкрадюкРедактор Г, Мозжечкова Техред М.Моргентал Корректор С. Патрушева Тираж Подписное НПО Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5:Заказ 9 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЙ МОРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ СОРТОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ, включающий проращивание семян исследуемых сортов, получение белкового экстракта из проростков, постановку иммунотеста полученного белкового экстракта с сывороткой на белки морозоустойчивого сорта и последующую оценку 10 , по результатам иммунотеста, отличающийСя тем, что, с целью снижения трудоемкости, повышения надежности определения И его ускорения, в качестве иммунотеста используют реакцию двойной иммунодиф-; 15 фуэии через барьер с применением трех Сывороток, две из которых, проявляющиеСя на белки проростков высокоморозоустойчивого сорта озимой пшеницы, стрессированных при отрицательной температуре, и белки одномесячных активновегетирующих растений, и одна барьерная - на белки проростков низкоморозоустойчивого сорта, а оценку осуществляют по отношению количества белка, при котором происходит взаимодействие белкового экстракта через барьерную сыворотку с проявляющей сывороткой на белки активновегетирующих растений, к количеству белка, при котором происходит взаимодействие белкового экстракта через барьерную сыворотку с проявляющейся на белки пшеницы высокоморозоустойчивого сорта, при этом чем выше величина отношения, тем более морозоустойчив сорт.