Способ определения минимальной подавляющей концентрации антибиотика

бег (54) ПОДАВЛ (57) ской ник ний.ностисроко к медицинс сти л м исс ль изобретения способа, а также шение тоеличение ос анения готовы иллюстрирует ланшет следую роков хр Способ римерами. Прим ую среду с ферменто микроорг ленный) Глюкозами р 1. Готовят и едующего состава изат биомассы ниэмов (осветательмас.й; 1,2 0,3 ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ 4428713/30-1318.05.8815.07.90. Бюл. У 26Всесоюзный научно-исследователь- институт антибиотиковБ.М.Бекбергенов, О.Н.Сперанская, Резван и П,С,Навашин615.779.9(0888)ТУ 59.045.62-86:пЕшапп Л, Еж пецез М 11 гозузМ 1 гоЬо 1 ог 1 е (1,аЪог Ргахз п ес 1 дг 1 п), 1981, Ч, р. 28-31. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИНИМАЛЬНОЙЯЮЩЕЙ КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИБИОТИКА Изобретение относится к медицин- микробиологии, в частности к клилабораторным методам исследоваЦель изобретения - повышение точспособа,а также увеличение в хранения готовых планшетов. Изобретение относитс ой микробиологии, в ча ико-лабораторным метод ий. 801578197 Питательная среда содержит следующеесоотношение компонентов, мас.7.: ферментолиэат биомассы микроорганизмов1-1,3; глюкоза О, 1-0,5; Фосфат натридвузамещенный 0,29-0,32; трифенилтетраэолий хлористый 0,07-0, 14; альгинанатрия 0,15-0,3; дистиллированная вода остальное. Готовят двукратные разведения антибиотика и полученные разведения вносят в лунки титрационногопланшета, После этого планшеты лиофилиэируют. При дальнейшем использовании в лунки вносят суспенэию микроорганизмов и инкубируют. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК)антибиотика определяют визуально поизменению темно-вишневого цвета среды, Первая лунка, в которой средаобесцвечивается, соответствует МПКантибиотика. 1 э.п. Ф-лы, 2 табл. Двуэамещенный натрияФосфат 0,3 Хлористый трифенилтетраэолий 0,1 Альгинат натрия 0,2 Дистиллированная вода Остальное В дистиллированной воде растворяют 1,2 г ферментолизата биомассы микроорганизмов, 0,3 г глюкозы и 0,3 г натрия Фосфата двузамещенного, тщательно перемешивают, доводят рН до 8,0-8,2 203 ХаОН, затем кипятят в течение 5 мин и Фильтруют, через бумажный фильтр. Устанавливают рН среды 7,6 концентрированным раство 1578197ром НС 1. Стерилизуют при 121 ф С в течение 15 мин.Готовую среду разливают до 30 мл в 96 стерильных мерных колб емкостью 100 мл.Для рвститровки одного антибиотика требуется 8 колб - 8 разведений. Э первой колбе - максимальная концентрация антибиотика (например, для10 бензилпенициллина она равна 32 мкг/мл). Колбу встряхивают до полного растворения и равномерного распределения антибиотика в среде. Затем половину Содержимого первой колбы переносят во вторую колбу с питательной средой - в этой колбе концентрация антибиотика в два раза меньше, чем в первой колбе (для бенэилпенициллина это 1 б мкг/мл). Вторую колбу встряхивают и снова, половину ее содержимого переносят в третью колбу, где концентрация препарата в два раза меньше, чем во второй колбе (для бензилпенициллина - 8 мкг/мл). Таким образом готовят все восемь разведений одного антибиотика, а затем готовят разведения остальных антибиотиков.Выбранные концентрации антибиотиков представлены в табл, 1.После раститровки всех антибиотиков в лунки планшета с круглым дном вносят по 0,1 мл раствора каждого антибиотика в таком порядке что первая лунка каждого из 12-ти рядов содержит максимальную концентрацию препарата, а далее следуют двукратноубывающие концентрации антибиотиковНапример, ряд с бензилпенициллином выглядит так: первая лунка 32 мкг/мл, вторая лунка 16 мкг/мл, третья лунка 8 мкг/мп, четвертая лунка 4 мкг/мл, пятая лунка 2 мкг/мл, шестая лунка 1 мкг/мл, седьмая лунка 0,5 мкг/мл, восьмая лунка 0,25 мкг/мл.Заполненные планшеты помещаются в холодильную камеру, где постепенноо понижают температуру до -40 С. Замораживание продолжают в течение 12 ч, После этого в холодильной камере устанавливают общее давление менее 100 мм рт,ст. повышают температуру на 10 С и выдерживают планшеты 40 - 50 мин, Затем постепенно поввшают температуру на 30 С, а когда планшеты нагреваются, поднимают температуру до 40 С. Планшеты выдерживают в этих условиях в течение 4 ч. За это время содержимое лунок полностью высыхает, образуя за счет альгинатанатрия тонко дисперсный осадок ввиде застывшей пены, прочно скрепленный с дном и стенками лунок.Иэ эталонной культуры Еэспег 1 сМасо 11 АТСС 25922 в пробирке с дистиллированной водой стерильно готовятсуспензию, соответствующую 5 ЕД пооптическому стандарту мутности, Инокулят в объеме 0,1 мл вносят в каждую лунку приготовленной системы спомощью пипеточного дозатора, Планшеты помещают в термостат и инкубируютпри 37 С в течение 18 ч,Оценку результатов исследованияпроводят визуально по изменению окраски от темно-вишневого до образования прозрачной среды беэ окрашивания,Концентрация антибиотика в последней лунке с .задержкой роста в рядуразведений антибиотика - прозрачнаясреда, без темно-вишневого окрашивания., соответствует значению минимальной подавляющей концентрации(МПК) данного антибиотика в отношении использованного эталонного штамма Е. со 1 АТСС 25922. Установленополное совпадение результатов по уровням МПК для всех 12 антибиотиков.П р и м е р 2, Питательную средуготовят в соответствии с примером 1по следующей прописи, мас.7:Ферментолизат биомассымикроорганизмов (осветленный) 1,0Глюкоза О,1Двуэамещенный натрияфосфат 0,29Хлористый трифенилтетразолий 0,07Альгинат натрия 0,15Дистиллированная вода ОстальноерН после стерилизации 7,2-7,4.Далее ход приготовления лиофилизированной системы микроразведений испособ определения МПК изученных антибиотиков для штамма Е. со 1 х АТСС 25922аналогичен примеру 1.Установлено полное совпадение результатов по уровням МПК для всехизученных антибиотиков.П р и м е р 3. Питательную среду готовят по следующей прописи, мас.й:Ферментолизат биомассымикроорганизмов (осветленный) 1,3157810,5 1 О 0,29-0,32 Таблица 1 32,0-0,25 32,0-0,25 32,0-0,25 512,0-4,0 128,0-1,0 128,0-1,032,0-0,25 32,0-0,25 128,0 - 1,064,0-0,5 32,0-0,25 БензилпенициллинОксациллинАмпициллинКарбенициллинЦефалотинКанамицинГентамицинАмикацинПолимиксинТетрациклинЭритромицин 1 люкозаДвузамещенный натрияфосфат 0,3Хлористый трифенилтетразолий 0,14Альгинат натрия 0,3Дистиллированнаявода ОстальноерН после стерилизации 7,2-7,4.Далее ход приготовления лиофилизированной системы микроразведенийи способ определения МПК изученныхантибиотиков для штамма Е со 11 АТСС25922 аналогичен примеру 115Установлено полное совпадение результатов по уровням МПК для всех изученных антибиотиков.В табл. 2 представлены результатыопределения МПК. 20В табл. 2 представлены результатыопределения МПК некоторых антибиотиковв отношении трех эталонных культурБсарйу 1 ососсиз аигецз ЛТСС 25923,Е. со 1 д ЛТСС 25922 и Рвепйошопаз 25аеги 1.поза АТСС 27853. Для них известны значения МПК выбранных антибиотиков, которые приведены в табл. 2 (длякаждой культуры - правый столбеццифр). В левом столбце приведены результаты определения МПК тех же антибиотиков, полученные с помощью известного способа и с помощью полуавтоматической системы М 1 Сизвестный).Как видно из табл. 2, модифицированный способ определения МПК антибиотиков позволяет значительно болееточно определять уровни антибиотикочувствительности,Использование способа позволяетповысить точность определения, упростить и ускорить его эа счет использования предварительно заготовленныхи лиофилизированных планшетов, которые могут храниться без потери актив 45ности антибиотиков в течение 12 мес.при 4 С,Формула изобретения 501. Способ определения минимальной подавляющей концентрации антибиотика путем приготовления двукратных серийных разведений антибиотика в питательной среде, содержащей источник азота,6соль натрия, фосфат и дистиллированную воду, с последующим заполнением лунок титрационного планшета приготовленными разведениями, внесением в них суспензии микроорганизмов, инкубированием посевов и учетов результатов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, питательная среда дополнительно содержит глюкозу и хлористый трифенилтетразолий, в качестве источника азота - ферментолизат биомассы микроорганизмов, в качестве соли натрия - альгинат натрия, в качестве фосфата двузамещенный фосфат натрия при следующем соотношении компонентов, мас.7:Ферментолиэат биомассымикроорганизмов 1,0-1,3Глюкоза О, 1-0,5Двузамещенный фосфатнатрияХлористый трифенилтетразолий 0,07-0,14Лльгинат натрия 0,15-0,3Дистиллированнаявода Остальное и учет результатов проводят по изменению цветности среды.2. Способ по п. 1, о т ли ч а ющ и й с я тем, что, с целью увеличения сроков хранения готовых планшетов, планшеты после заполнения лунок средой с антибиотиком лиофильно высушивают. Антибиотики Область двукратныхразведений в мкг/мллло о о л л 3 СЧ о о Ю ооо оо ооооолсчл с л л Ч; л л л л л л л сч сосо сососч оо оо л лг ф с. 1 1М 1 а 1 уо 1 Н м 11Са мо съСОНСС СЧН ОЭ Оа НС ооооо о . о л л л л о о до СЧ К4,) 1 1 СЧ л л л) Ч;) ф - О со м сч о со