Способ диагностики обострения стрептококковой инфекции

(зз 6 01 й 33/5+; 11 13 .ЕТЕН эо Из пальцго скарификви, которатермостатеРифугируютоб/мин. Откость и Готоном фиэи ГОСУДАРСТВЕН)ЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗО К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Институт клинической и экспериментальной медицины СО АМН ССС(56) Наставление по применению сухог препарата стрептолиэин О для определения антистрептолизина О в сыворотках боль;-ых,Утверждено 19,09.73., МЗ СССР.(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОБОСТРЕНИЯСТРЕПТОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ(57) Изобретение относится к медицине, аименно к диагностике заболеваний, вызванных Р -гемолитическим стрептококком группы А - ревмагизма, тонзиллита,пиелонефрита и гломерулонефрита. Цель иэоИзобретение относится к области медицины и может найти применение в диагностике заболеваний, вызванных /) -гемолитическим стрептококком группы А - ревматизма, тонэиллита, пиелонефрита и гломерулонефрита.Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа за счет использования стрептолизина О, иммобилизованного на окрашенном носителе.Способ осуществляют следующим обраа пациента с помощью разовоатора берут 0,25 - 0,30 мл кроя затем выдерживается в до полного свертывания, цент- кровь в течение 15 мин при 1500 сасывают надосадочную жидят ее разведения в эабуференологическом растворе в бретения - повышение точности и ускорение способа, Для этого из пальца пациента берут 0,25 - 0,30 мл крови и отделяют сыворотку, Готовят ее разведение в эабуференном физиологическом растворе в соотношениях по объему 1:2, 1:4, 1;6, 1:8, 1;10, 1:12, 1:16, 1:20, 1;40, 1:70 и добавляют по 0,1 мл полученных растворов в лунки иммунологического планшета. в которые предварительно внесено по 0,15 мл 0,75- ного раствора визуализированного стрептолизина О в забуференном физиологическом растворе. Планшет слегка встряхивают, инкубируют 40 мин при 37 С, затем читают результаты реакции. Способ позволяет сократить время исследования до 1 - 2 ч, по- Б высить точность способа эа счет повышения чувствительности, исключить необходи,мость забора крови из вены больного. 1 табл.ф соотношениях по объему 1:2, 1:4, 1;6, 1;8, 1:10, 1;12, 1:16, 1:20, 1:40, 1:70. В каждую из 11 лунок планшета для иммунологических реакций вносят по 0,15 мл 0,757 ь-ного раствора визуализированного стрептолиэина 0 О в забуференном физиологическом раство- С 1 ре, Затем в первую лунку вливают 0,1 мл 0 с забуференного физиологического раствора - эта лунка служит для контроля за возможной неспецифической агглютинацией (контрольная лунка). Во вторую лунку вносят 0,1 мл сыворотки пациента в разведении 1:2, в третью - 1:4, в четвертую - 1;6, в пятую - 1;8, в шестую - 1;10, в седьмую - 1:12, в восьмую - 1:16, в девятую - 1;20, в десятую - 1;40, в одиннадцатую 1:70. Эти лунки являются опытными, Планшет слегка встряхивают в течение 1 мин и помещают в термостат при 37 на 40 мин, затем вынимают и читают1670606 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5055 3результаты реакции. Агглютинация во второй лунке, куда была внесена сыворотка пациента в разведении 1:2, соответствует титру антистрептолизина О 1;2, агглютинация в третьей лунке титру 1:4 и т,д. При обследовании предлагаемым способом 30 чел. отработаны количественные критерии (в титрах и в единицах активности антистрептолизина О-АСЛО) отсутствия и наличия стрептококковой инфекции и степени активности процесса.Для больных со стрептококковой инфекцией вне обострения характерны титры 1:2 - 1:4(65-125 ед. АСЛО), для больных с умеренной активностью процесса 1:6 - 1:8(165-250 ед. АСЛО), а для больных со стрептококковой инфекцией с выраженной активностью от 1;8 и выше (250-625 ед. АСЛО),Визуалиэированный препарат получен следующим образом. За основу для визуалиэированного препарата взяты гранулы синего декстрена. Навеску синего декстрана в количестве 300 мг растворяют в 10 мл 0,1 М калий фосфатного буфера рН 8,0, добавляют равный объем 40 ф-ного этанола в 0,1 М калий фосфатном буфере, рН 8,0, содержащего 50 мг бензохинона, инкубируют в течение 5 - 8 ч при комнатной температуре с перемешиванием. Берут аликвоты по 0,3 мл, центрифугируют их при 3000 об/мин в течение 15 с. При появлении осадка реакцию прекращают добавлением 3 мл 0,5 М натрий ацетатного буфера, рН 3,0. Гранулы осаждают 50-ным этанолом, осадок промывают 507 ь-ным этанолом и высушивают в термостате при 37 С. Размер гранул не превышал 2 мкм, Гранулы декстрана растворяют в 0,1 М калий фосфатном буфере рН 8,0, содержащем стрептолизин О в концентрации 5 мг/мл ( 1 ч. стрептолизина О на 5 ч, гранул декстрана), Смесь инкубируют 16 ч при комнатной температуре с перемешиванием, затем блокируют сводобные остатки бензохинона яичным альбумином в концентрации 5 мг/мл и глицином в концентрации 5 мг/мл. Гранулы осаждают 506-ным этанолом и после промывки 506-ным этанолом переводят в забуференный физиологический раствор. В растворе гранулы сохраняют стабильность в течение 3 - 4 недель при 4 С, При хранении к взвеси добавляют азид натрия. Таким образом единожды приготовленный визуалиэированный стрептолизин О можно использовать в течение 1 мес. П р и м е р 1, Больная Т. (Э детскаябольница). Кровь на анализ по предлагаемому способу взята 25,09,87, Хронический тонзиллит, гноя нет, яркой картины активногопроцесса нет, однако иэ зева высеян стрептококк. Поэтому процесс расценивался какактивный. Результат обследования по предлагаемому способу - титр 1:8.П р и м е р 2. Больная К. (3 детскаябольница), Кровь взята на анализ 23,09.87.Хронический декомпенсированный тонэиллит, гной, температура субфибрильная, Активный процесс. Титр 1;20.П р. и м е р 3. Больная С. (3 детскаябольница). Кровь взята на анализ по предлагаемому способу 08,09.87. Ревматизмст. активности. Титр 1:10.П р и м е р 4, Больной Б. (Э детскаябольница). Кровь взята на анализ 29,09.87,Хронический тонэиллит, аденоиды. Выраженных проявлений активности нет, Больной лечился в течение 18 дней, Результат попредлагаемому способу - титр 1:8,П р и м е р 5, Больной Б. (3 детскаябольница), Кровь взята на анализ 18,09.87.Ревматизм О ст. (вне обострения), Титр 1:4.П р и м е р 6. Больная С диагноз ревматизмст. активности, При использовании0,75 визуализированного стрептолиэинаО агглютинация произошла в лунке с разведением сыворотки 1;10, при использовании визуализированного стрептолиэина О вконцентрации 0,50 ф(, агглютинация произошла в лунке с разведением сыворотки 1:8, Такимобразом, при использовании концентрациивизуалиэированного стрептолизина О меньше0,750 ь чувствительность способа падает.При концентрации стрептолизина О,визуалиэированного с помощью декстрана -1,00, чувствительность способа диагностики не возрастает.П р и м е р 7. Больная С ревматизмст., активности. При использовании виэуалиэированногострептолизина О в концентрации 1,00 агглютинация отмечена в лунке сразведением сыворотки 1:10, что отмечается и при использовании визуализированного стрептолизина О в концентрации 0,75.При концентрации 1,50 (вдвое большейпредлагаемой в способе) результаты агглютинации трудно учитывать из-за высокойконцентрации визуализированногострептолизина О.Таким образом, оптимальной являетсяконцентрация визуализированного стрептолиэина 0 - 0,75.П р и м е р 8. Больная С.,диагноз -ревматизмст. активности, При инкубациив течение 35 - 40 мин агглютинация произошла в лунке с разведением сыворотки51015 1:10. При инкубации материала в течение 25 мин агглютинация не отмечается ни в одной из лунок.При инкубации материала 1 - 2 ч агглютинация отмечена в лунке с разведением сыворотки 1;1 О. При инкубации материала в течение 3 - 4 ч картина агглютинации также не меняется.Таким образом время инкубации 35-40 мин является оптимальным.Положительный эффект от использования предлагаемого способа состоит в следующем,Повышается доступность способа для клиник (а не только для единичных диагностических центров) в связи с исключением использования взвеси эритроцитов человека или кролика, приготовляемой в день постановки реакции,Для определения стрептококковой инфекции по прототипу требуется не менее 0,5 мл крови пациента. Ее забираю из вены или пальца пациента, причем на практике обычно из вены, Забор крови из венц при отсутствии одноразовой иглы мож создать угрозу инфицирования пациента, В предлагаемом способе кровь забирают только иэ пальца пациента разовым скарификатором, поэтому предлагаемый способ более безопасенПредлагаемый способ является менее времяемким по сравнению с прототипом. На операции, общие для обоих способов, в прототипе требуется 4 - 28 ч, а в предлагаемом способе 1 ч 10 мин, а с учетом пассивных затрат времени на инкубацию растворов при приготовлении визуализированного стрептолизина О менее 2 ч,Повышение точности способа подтверждается следующими примерами,Больной А., 12 лет, 3 ДКБ, г. Новосибирск. Хронический декомпенсированный тонзиллит, обострение. Анализ от 15.05,87. АСЛО - 165 ед, Предлагаемый способ - 1:8(250 ед.).Анализ по прототипу(165 ед. АСЛО) соответствует состоянию "вне обострения" или "умеренная активность процесса", Анализ по предлагаемому способу показал более высо 20 25 30 35 40 45 кое содержание антистрептолиэина О (250 ед. АСЛО), что соответствует состоянию между умеренным и активным процессом. У ребенка хронический декомпенсированный тонзиллит в стадии обострения. Предлагаемый способ диагностики точнее отразил реальное состояние больного.Больной 311 лет. 3 ДКБ, г. Новосибирск. Ревматизм ст., активная фаза, миокардит активность - И ст.Анализ от 24. 04, 87. АСЛОед.Предлагаемый способ 00 (313 ед.). Анализ от 24,04,87, АСЛО - 250 ед. Предлагаемый способ 1:10 (313 ед.).Анализ по прототипу дает представление об активности процесса, но в анализе по предлагаемому способу цифры выше. Больной 3., 14 лет. 3 ДКБ, г, Новосибирск. Полиартрит вирусной этиологии, ОРЗ, Анализ от 15,05,87, АСЛО - 250 ед. Предлагаемый способ - 1:2 65 ед,),У больного 3, нет стрептококковой инфекции (у,него полиартрит вирусной этиологии), что и отражает анализ по предлагаемому способу. Анализ по прототипу ошибочно показывает наличие стептококковой инфекции,Больной 311 лет. 3 ДКБ. г, Новосибирск, Хронический тонэиллит после лечения, вне обострения. Анализ от 20.05.87. АСЛО - 65 ед, Предлагаемый способ - 1:2 (65 ед,), Анализы по обоим способам совпадают и верно отражают состояние больного,Показатели диагностики стрептококковой инфекции при использовании прототипа и предложеного способа представлены в таблице.Формула изобретения Способ диагностики обострения стрептококковой инфекции путем выявления антител к стрептолизину О в реакции агглютинации, отл и ча ю щи й с ятем, что. с целью повышения точности и упрощения способа, к сыворотке больного добавляют 0,75 стрептолиэинО, иммобилизованный на окрашенном носителе, затем термостатируют в течение 35 - 40 мин, учитывают результаты реакции и при значении титра антител 1:8 - 1:20, диагностируют обострение стрептококковой инфекции.1670606 Группы о бследованных Прототип АСЛО (МфщЭ Титр антител попредлагаемомуспособу М лмин-макс мин-макс 225,0-8 Э,О(65-50)нет достоверности Больные со стрептококковой инфекцией, в процессе лечения 22 чел 188, 6-51, 7(65-250) Больные стрептококковой инфекцией вйе обострения - 22 чел,Нет достоверныхразличий междугруппами 1-2;2-3, 1-3 Составитель К.АртюшинвТехред М.Моргентал Корректор О.Кравцова Редактор О.Спесивых Заказ 2748 Тираж 390 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раущская наб., 4/5 Производственно-издательский комОинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Больные со стрептококко-вой инфекцией, актйвныйпроцесс (ревматизм 1 активная фаза, активность111 ст., обострение хр.тонзиллита) - 22 чел,до лечения 1; З,ЗЙ 0,4