Способ получения окрашенного субстрата для определения полигалактуроназной активности

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 09) И 1) С 12 Ч 1/3 ТЕН ОКРАШЕННОГО СУБ ПОЛИГАЛАКТУРОвенное объедисится к зн ой и пищев к способа рментов, Ц ение субст Са ви цкенеДенис опрель ата, ние ст- ого льство СССР9/36, 1983С.И, Б 1 тпр 1 е Пуепп 1 пхпв ЕппоресАгс. Гоос 1,2-985. ти и упрощ пособ осущ ия пектино ви нил рко-оран" Ридр) пекти норисутст" с ,5"8 Мсителемктивный о-синий от масс80 Свтра ции2 з,п. лы,1 ил осится к энзимоломи кроби ологич есышленности, а имендел е ни я а кти вности и оран- кового яют ливепрв ашенсм но ви акт ас- исОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И О 1 НРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕН А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ 21) 4416362/3 0-13(56) Авторское свидетЯф 1112058, кл, С 12 ИРгхепй 0.К., СЬащКе 1 еаве Лввау Йог Весг 1 паве асг 1 чх 1 у. - 1.СЬет 1982, 30, р. 9 И зобрет ени е от н гии, ми кробиологии кой и пищевой пром но к способам опре ферментов,Цель изобретения " удешевление субстрата, сокращение длительности упрощение процесса получения окр ного пектинового вещества. Окрашенный субстрат согласно из бретению получают путем окраши вани пектинового вещества (пектин, пек" товая кислота) с последующим осажд,нием целевого продукта и его отдел нием от несвязанного красителя мно кратным вымыванием органическим р творителем, В качестве красителя(5 ч) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯСТРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ(57) Изобретение отногии, микробиологицескмышленности, а именноделения активности феизобретения - удешевлсо кра щени е длит ел ь носпроцесса субстрата .вляют путем окрашиванвещества активным красульфонового ряда (ажевый ЖТ, Ремазол яркв колицест ве 50-500вого вещества при 30 вии мочевины в конценв реакционной смеси,табл. льзуют активныи краситель винилльфонового ряда (активный ярковый ЖТ, Ремазол ярко-синий Р) в цестве 50-5003 от массы пектино щества, а окрашивание осуществл и 30-80 С в присутствии моцевины концентрации 0,5-8 М в реакционной еси при рН 11,0-11,5.При мене ни е а кти в ног о ви нилс ул ьфо" вого красителя в присутствии моче" ны для окрашивания пектина позволя- проводит ь процесс окра ши ва ни я за 25-1 ч, Это объясняется тем, что ивные винилсульфоновые группы асителя непосредственно образуют валентные связи с гидроксильными уппами пектина в щелочной среде в1984новой кислоты (полигалактуроновая кислота) фирмы нВегча", 240 г (8 М) мочевины и 70 г (5003) активного красителя Ремазола ярко-синего Р. Полученнуюреа кционную смес ь нагревают на водяной бане до 80 С и инкубируют 1 ч,после чего доводят рН среды до 11,30,1 н раствором едкого натра и перемешивают при той же температуре 1 ч.Далее выделение продукта и его отмывку проводят так же, как в примере 1,Получают 10 г окрашенного субстратав виде синего порошка, растворимогов воде. Коэффициент экстинкции 1 г-ного раствора Е 5, = 5,6П р и м е р 6. Определение полигала кт урона зной а кти вности,8 две пробир ки нали вают по 4 см13-ного раствора субстрата в 0,1 Ма цетат ном .буфере, р Н 4, 5 и термостаотируют 5 мин при 40 С. В одну пробир 3ку приливают 1 см Ферментного раствора пектиназы из А. пЦег фирмы"Бега" с концентрацией 0,1 мг/смили полигалактуроназы из ЕуцойаЬоврога пигхапа 848 с концентрацией0,75 мгУсм, в другую " 1 см буФераз(контроль) и инкубируют при 40 С втечение 20 мин, после чего в каждуюпробирку добавляют 5 см этанола.Реакционную смесь взбалтывают и фильтруют через бумажный фильтр (краснаялента), Измеряют оптическую плотностьполученного фильтрата против контрольной пробы при длине волны 490 или595 нм (в случае субстрата, полученного по примеру 3) . Полигалактуроназную активность (ПГА) определяютпо Формуле 1578 присутствии мочевины, Поскольку окрашивание пектина винилсульфоновым красителем осуществляют в сильнощелочной, среде (рН 11, 5) в присутст вии мочевины, способ позволяет исключить гомо" генизацию пектина перед окрашиванием.Изобретение иллюстрируется примераМи.П р и м е р 1. К 500 мл дистилли- О рованной воды при перемешивании небольшими порциями добавляют 14 г цитрусового пектина, 15 г мочевины (0,5 М) и 7 г (503) активного красителя ярко"оранжевого ЖТ. Полученную реа кционную смес ь нагревают на водяной бане до 50 С и инкубируют 1 ч после чего доводят рН среды до 11,5 0,1 н, раствором едкого натра и перемешивают при той же температуре 0,25 ч, Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и выпивают в 1000 мл ацетона. Образовашийся же" леобра зный осадок пер емеши ва ют 20 ми н и отжимают через капроновую ткань, 25 Массу отжатого продукта заливают 1000 см 503-ного раствора ацетона (по объему), перемешивают при комнат" ной температуре в течение 30 мин, осадок продукта отстаивают в течение 20 мин, надосадочную жидкость слива 30 ют, а продукт отжимают через капроновую ткань. Отмывку несвязанного красителя повторяют еще 5-6 раз, после чего промывают окрашенный продукт ацетоном,и высушивают в сушильном шка-З Фу при 70 С в течение 10 ч. Получаюто1 О г субстрата в виде оранжевого порошка,. хорошо растворимого в воде. Коэффициент экстинкции 17.-ного раствора субстрата Е 4 = 3,9П р и м е р 2. При перемешивании маленькими порциями добавляют в 500 см дистиллированной воды 14 г3свекловичного пектина, 150 г (3 М) мочевины и 28 г (2003) активного красителя ярко"оранжевого ЖТ. Полученную реакционную смесь нагревают на водяной бане до 65 С и инкубируют 1 ч, после чего доводят рН среды до 11,0 0,1 н. раствором едкого натра и пере- И мешивают при той не температуре 0,5 ч. Осаждение окрашенного продукта и от" мывку несвязанного красителя проводят так же, как в примере 1. Получают 10 г субстрата Коэффициент экстинкции 55Р/ 10."ного раствора субстрата Е 47= 6,0.П р и м е р 3. При перемешиваниималенькими порциями в 500 см дистиллированной воды добавляют 14 г пектоПГА = -- -1000Р Чт ггде Р - оптическая плотность фил ьтрата;Ч - объем реакционной смеси, см(5 см );г - время гидролиза, мин (20 мин);ш - коли чест во фермент ного препарата, взят ог о для а нали за, мг, 1000 - коэффициент пересчета ферментативной активности на 1 гпрепарата .За единицу ПГА принимают такое количество фермента, которое за 1 мин приводит к увеличению оптической плотности фильтрата реакционной смеси на одну оптическую единицу,В таблице приведены данные, свидетельствующие о пригодности субстра. Субстрат По примеру 1 Пекти на за и 3Авр пЦег 0,22 0,52 0,49 а, 17 0,39 0,35 3,9 6,0 5,6 1300 1225 56 130 116 Фирмы "Яегча"Полигалактуроназаиз 2 увоаЬоврогавагх 1 апа 848 3,9 6,0 5,6 По примеру 1 На чертеже показана зависимость скорости гидролиза окрашенного пектина, полученного по примеру 2, от концент ра ции Фермент ного раст вора пек" тиназы из А.пз 8 ег. Эту зависимость определяли по описанной методике определения полигалактуроназной активности. Как видно из чертежа прямолинейная зависимость оптической плотности (040) от концентрации фермента сохраняется до 0,6 оптической плотно" сти и обеспечивает вполне достаточный интервал для определения полигалактуроназной активности.П р и м е р 4. Окрашивание цитру сового пектина активным красно-коричневым РКТ, осаждение продукта и от" мывку несвязанного красителя прово" дят аналогично примеру 3. Получают 10 г субстрата. Коэффициент экстинкции 13-ного раствора Е 4 = 6,4.П р и м е р 5. Окрашивание цитрусового пектина активным бордо 4 СТ и вьделение продукта проводят так же, как в примере 2. Получают 10 г суб" 1. Способ получения окрашенного субстрата для определения полигалактуроназной активности, включающий ковалент ное присоеди нение к пекти новому веществу азокрасителя с после" дующим вьделением целевого продукта путем осаждения и отделением несвязанного красителя, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью удешевления субстрата, сокращения длительности и упрощения процесса, в качестве красителя используют активный краситель винилсульфонового ряда, взятый в количестве 50-500 ф от массы пектинового вещества, а окрашивание осуществляют в присутствии мочевины при рН 11"11,5.2. Способпоп.1, отли ча ю" щ и й с я тем, что применяют мочевину в концентра ции 0, 5-8, 0 М.3, Способпоп. 1, отлича ющ и й с я тем, что окрашивание ведут при 50-80 С.1578198 Составитель А, СеменовРедактор А, Маковская Техрер М,Дидык Корректор Л.Бескиа Заказ 1892 Тираж 488 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открыт 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4 и ГКНТ СССР ф Производственно-издательский комбина 1 У иена фбуиЕитамг/ем тент", г. Ужгород, ул. Гагарина