Способ получения магнитных микроносителей для культивирования клеток эукариот

(51) С 125/00, 11/02 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Институт биоорганической химии им,М.М,Шемякина АН СССР и Научнопроизводственное объединение "Биолар" (72) С.И,Туркин, Ю.В.Лукин, Е.А,Марквичева, Р.А,Али-Зад В.П,Зубов, М.А,Завальный, А.Г,Скуиньш, М,К.Калявиньш и А,Х,Зицманис(56) Международная заявка, РСТ/Вц 86/00083, кл, С 12 Н 5/00, 1986.Международная заявка, РСТ/)В 81/01098, кл. С 12 М 11/10, 1982,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАГНИТНЫХ МИКРОНОСИТЕЛЕИ ПЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЭУКАРИОТ(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к усовершенствованному способу получения магнитных микроносителей для культивирования клеток эукариот. Цель изобретеИзобретение относится к биотехнологии, в частности к усовершенство" ванному способу получения магнитных микроносителей (ММН) для культивирования поверхностно-зависимых клеток эукариот, и может найти широкое применение в ветеринарной и медицинской промышленности для выращивания клеток и размножения вирусов на них с целью создания вакцин и сывороток, а 2ния - упрощение способа и улучшение качества целевого продукта эа счет увеличения прироста клеток на микро- носителях. Способ заключается в обработке раствора желатина поперечносшивающим агентом - глутаровым альдегидом, размельчении блок-полимера с целью получения частиц определенного размера и обработке полученных протеолитическим ферментом, При этом предварительно проводят введение в раствор желатина частиц магнитного наполнителя размером 0,005-0,05 мкм (оксидов металлов переменной валентности) в соотношении магнитного наполнителя и желатина 1;(0,5-10), На полученных таким способом микроносителях прирост клеток перевиваемой линии КН .повышается в 1,6-2,5 раза по сравнению с микроносителями, полученными по известному способу, Упрощение способа достигается за счет исключения стадии дисперсионной кон; енсации, 2 з,п. ф-лы, 1 табл,также для получения секретируемых клетками эукариот важных биологически активных веществ, таких как (3- и-интерфероны, активатор плазминогена, гормон роста и др. Цель изобретения - упрощение способа и улучшение качества целевого продукта эа счет увеличения прироста клеток на микроносителях.Способ заключается в диспергировании магнитного наКопителя (НН) на основе оксидов металлов переменной валентности с размером частиц 0,005- 0,05 мкм в растворе желатина, обработке полученной суспензии глутаровым альдегидом и размельчении образующегося геля для получения частиц микроносителя,. Последние обрабатывают про 15теолитическими ферментами до исчезновения шероховатости поверхности,В качестве оксидов металлов используют оксиды железа, кобальта и никеля, а соотношение магнитного носителя и желатина устанавливают равным1:0,5 - 1;10. Использование предлагаемого способа позволяет значительно тиц магнитного наполнителя 0,005 мкм.К образовавшейся суспензии добавляют35 мл 25":-ного водного раствора глутарового альдегида и интенсивно перемешивают в течение 15 мин., Послевыдерживания в течение 15 мин при20 С блок геля продавливают черезсито с диаметром отверстий 200 мкм.Полученные цастицы отмывают водой отглутарового альдегида, затем обрабатывают 200 мл 0,251-ного растворатридсина в 0,01 М фосфатном буфере(рН 7,6) в течение 3 мин при комнатной температуре и постоянном переме"шивании, Для удаления остатков фермента частицы микроносителя промывают 0,011-ным раствором этилендиаминтеграуксусной кислоты, суспендируют 45 50 55 упростить процесс полуцения микроносителей за счет исключения стадии 20 дисперсионной конденсации, на которой применяют специальную аппаратуру и органические растворители, а также улучшить качество целевого продукта за счет увеличения прироста клеток 25 в 1,6-2,5 раза,П р и м е р 1, Соли, РеБО 7 Н,О (35 г) и ГеС 16 Н,О (50 г), растворяют а 110 мл Н,О каждую, растворы объединяют и при перемешивании пос; епен- ЗО но приливают 100 мл 25.-ной гидроокиси аммония. Выпадает тонкодисперсный осадок магнетита Ге О , который трижды промывают подкисленной дистиллированной водой, К промытому осадку (25 г) добавляют 400 мл 251-ногораствора желатина при 50 С в воде (весовое соотношение МН и желатина 1:4) и при перемешивании до однородной суспензии нагревают в течение 40 20 мин при 50 С. Средний размер часв 0,15 М растворе ЯаС 1, стерилизуютпри 120 С и 07 ати в течение 20 мин.Получают 300 г ММН с содержанием8,5 Ж ГеО. В процессе обработки ММНпротеиназами осуществляют визуальныйконтроль под микроскопом и,обработкуферментами ведут до исцезновенил шеооховатости частиц.П р и м е р 2. ММН получают попримеру 1, но на 5,0 г осадка Ге Одобавляют 200 мл 25 к,-ного растворажелатина ,весовое соотноше ие МН ижелатина 1:10). Получают 250 г ММНс содержанием 21 Ре ОаП р и м е р 3, ММН полуают попримеру 1, но на 25 г осадка Ге,О,тдобавляют 50 мп 25."-ного растворажелатина (весовое соотношение МН ижелатина .1:0,5). Получают 125ММНс содержанием 25 1 еОэ,П р и м е р 4 ММН получают попримеру 1, но к 4,1 г осадка Г .Одобавляют 200 мл 251-ного растворажелатина (весовое соотношение МН ижелатина 1: 12) . Получают 24 0 г ММНс содержанием 0,9/ ГеО.П р и м : р 5, К 25 г осада Ге С,который получен и промыт по примеру 1,опри перемешивании и 50 С добавляют200 мл 252 ного рас 1 в,ра же-этина вводе (сс;,тношение МН и желатина 1:2),Полуценну суспензик., содержащую частицы МН -; е О - размером О,ООЬ ч;м,подвергают дальнейшей обработке, добавляя 35 мп 25-ногс водного раствора глут рвогс альд гида.,Далее весьпроцесс прсводят по примеру 1, Полуцают 350 г ММН с содержанием 16,2;ГеЗО 4П р и и е р 6, Сопи, 54 г РеС 1 х6 Н.О и 24 г СоС 1, 6 Н-О, растворяютв 50 мл воды каждую, растворы объедионяют, нагревают до 90 С и при перемсшивании приливают 150 мл 25-ногораствора гидроокиси натрия. Перемешивают в течение 1 О мин. Образовавшийся осадок СоГе,О с размером частиц 0,03 мкм промывают раствором соляной кислоты (0,05 М) до рН 6-8, Кпромытому осадку добавляют 400 мл20-ного раствора желатина в воде(соотношение МН и желатина 1:3), перемешивают до образования однороднойсуспензии и нагревают в течение 30 минпри 90 С. Все дальнейшие операции,начиная с добавления 35 мл 251-ногораствора глутарового альдегида, осуществляют по примеру 1. Получают45 400 г ММН с содержанием 6,4 Ж ферритакобальта.П р и м е р 7. Соли, 54 г РеС 1 хх 6 НО и 20 г Ч 1 С 1, растворяют в550 мл воды каждую, растворы объединяют и нагревают до 90 С, При перемешивании добавляют 150 мл 25 ь-ногораствора гидроокиси натрия и продолжают перемешивание в течение 40 мин 1 рпри той же температуре, Образовавшийся осадок (ИЮе 04 с размером частиц 0,05 мкм) промывают раствором0,05 М соляной кислоты до рН 6-8, Кпромытому осадку добавляют 400 мл203-ного раствора желатина соотношение МН и желатина 1:3), перемешиваютдо образования однородной суспензияи нагревают в течение 30 мин при 90 "Все дальнейшие операции, начиная сдобавления 35 мл 25 Й-ного раствораглутарового альдегида, осуществляютпо примеру 1. Получают 410 г микро.носителя с ссдержанием 6,83 ферританикеля.25П р и м е р 8. Процесс осуществгяют по примеру 1, но .о-ученные частицы после отмывки вг ц.й от ггутаровогоальдегида обра".ать аают 20 мг 0,204-ного раствора х - .ч отр псин- в 0,01 М ЗОфосфатном буфер-., ", 7,6, олучают295 г ММН с содвзжанием 8,5 ."езл,П р и м е о 9. Грануль микроносителя, полученные по примеру 1, помещают в 0,25/-ный раствор кэллагеназьв 0,15 М фосфатном буфере с рН 7,6(из расчета ОО мл раствора ферментан: 250 г гра ул микроносителя) и выдерживают, перемешивая гари комнатнойтемпературе г,о образования гладк хй 40поверхности гранул, ксторое фиксируютвизуальным наблюдечием ггод микроскопом, Время обоаботки 3,5 мин. Затемостатки фермента удаляют, а продуктпромывают по примеру 1,Оптимальное весовое соотношениеМН и желатина 1;(0,5-10). ПолучениеММН при весовом соотношении ,енее:0,5 затруднител-,но из-з;. возрастаниявязкости раствора, а при соотношении 50более 1:10 нецелесосбоазно, так какприводит к получению частиц с низкимсодержанием МН Гменее 2 Ъ), а такжек снижению прироста клеток.Использование частиц М: меее550,005 мкм невозможно, так как этотразмер имеет однодоменная частица МН,а более 0,05 мкм нежелательно, таккак уменьшается прирост клеток,С целью получения гладкой поверхности магнитного микроносителя, которая необходима для эффективного прикрепления клеток, частицы микроносителя обрабатывают протеолитическими ферментами, Используют трипсин, химотрипсин и коллагеназу при концентрации 0,2-0,251. В процессе проведечия обработки осуществляют .визуальный контроль под микроскопом за поверхностью гранул и обработку фер" ментом ведут до исчезновения шеро" ховатости поверхности, Это время составляе обычно 2,5-3,5 мин, Более длительная :бработка нежелательна, тзк как при этом разрушаются гранулы микроносител, Нежелательно также использовани" бглее высоких концентраций ферментов ввиду того, что сокращается влемя обработки, что создает спожносгь в установлении момента оконаения этой стадии. На микроносителях, полученных согласно примерам 1-9, выращивают поверхностно-зависимые клетки почек эмбриона человека перевиваемой линии КН, Культивирование проводят на среде 199, содержащей 3-104 бычьей сыворотки, во флаконах объемом 250 мл с магнитной мешалкой. Клетки высевают, используя на начальном этапе 20 объема (30 мл) питательной среды от конечного, После засева клеток суспе нзию периодически перемешивают по 1- мин с интервалом 30 мин в течен е 3-4 ч. По окончании процесса прикрепления клеток к микроносителям объем среды доводят до конечного Г 150 мл), концентрация клеток при этом составляет ,0 10 кл/мл, и устачавпивают постоянный режим работы мешалки - 40 об/мин, Концентрация микрон:.сителей в конечном объеме сре" ды составляетсмз глотного осадка на 1 Ь мл питательной среды, что об печивает площадь около 15 см 2 на 1 мл среды. Процесс культивированияоосуществляют при 37 С в течение 7 сут. На 3 сут кульгивирования среду заменяю на 70. По окончании процесса клетки снимают, оГрабатывая их 20 мл раствора, содержащего 0,025 ь трипсина и 0,02 ь ЭДТА, Количество выросших клеток определяют, подсчитывая их в гемоцитометре после окрашивания три-пановым синим, Коэффициент прироста 9клеток рассчитывают по отношению1567623 3. Способ по и.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве оксидов металлов переменной валентности используют оксиды железа, кобальта или никеля,Коэффи циент приростаклеток Микроносители попримеру Концентрациявыросших клеток, кл/мл 1,6 1 О 4,0 3,810 2510 2,610 1,8 10 4,1 10 2,91 О 3,210 3,8-10 3,610 9,5 6,3 6,5 4,5 10,2 7,2 8,0 9,5 9,0ВВ Составитель В.МуронецРедактор М.Петрова Техред И.Дидык Корректор В.Кабаций Заказ 1302 Тираж 495 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул,Гагарина, 101 концечтрации выросших клеток к их посевной концентрацИи.В таблице приведены сравнительные данные по культивированию перевиваем5 мои линии КН-клеток почекэмбриона человека.Таким образом, предлагаемый способ позволяе г упростить технологию получения магнитных микроносителей 1 О для культивирования клеток эукариот благодаря исключению стадий дисперсионной поликонденсации и улучшить качество микроносителей за счет увеличения коэффициента прироста клеток 15 на предлагаемых магнитных микроносителях в 1,6-2,5 раза по сравнению с чосителями, полученными по известному способу, Кроме того, магнитные микроносители, получаемые предлагае мым способом, содержат заданное количество магнитного носителя, что позволяет использовать их в процессе магнитоуправляемого культивирования,25 Формула изобретения 1, Способ получения магнитных микроносителей для культивирования клеток эукариот, включающий смешивание раствора желатина с магнитным напол нителем из оксидов металлов переменной валентности, получение частиц микроносителя с проведением обработки желатина глутаровым альдегидом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и улучшения качества целевого продукта за счет увеличения приростка клеток на микроносителях, в качестве магнитного наполнителя используют частицы оксидов ме таллов переменной валентности размером 0,005-0,05 мкм, обработку желатина глутаровым альдегидом проводят пепед получением частиц микроносителя,а частицы микроносителяполучают размельчением геля с последующей обработкой их протеолитическими ферментами до исчезновения шероховатости поверхности,2, Способ по и.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что соотношение магнитный наполнитель и желатин устанавливают равным 1:0,5-1:10,По известному способу По предла гаемомо спо собу1 2 3 4 5 6 у 8 9