Способ получения агрегата микробных клеток

О П И С А Н.".И,Е ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз СоветскихСоциалистиц вскихРеспублик Н ПА 1 ЕНеУ(45) Дата опубликования описания 11.08,78 ДГосударстееннцв комнтет Совета Мннестроа СССР ое делам нзебретенне и открытийИностранец Маргарет Эстер Лонг(72) Автор изобретения Иностранная фирма(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АГРЕГАТА МИКРОБНЫХ КЛЕТОКИзобретение касается анзиматического, процесса с применением иммобялизированных микробных клеток, а именно способа получения агрегата микробных клеток.Микробные клетки, имеющие связанные 5 с ними активные энэимы, флоккулируются в присутствии некоторых металлических соединений и образуют стабильные, содер жащие клетки, агрегаты. Согласно известному способу получении указанных агре гатов осуществляют культивирование микроорганизмов в жидкой питательной среде, вводят флоккулянт, в качестве которого используют, например, Примафлок, СА, отделяют полученные агрегаты от 15 культуральной жидкости, осуществляют экструзию флоккулированных клеток, а затем их сушат 1 .Однако полученные данным способом агрегаты микробных клеток недостаточно Ю твердые .и стойкие. С течением времени имеет место потеря их внаиматичвской активности.С целью увеличения твердости и стабильности агрегатов клеток согласно предлагаемому способу перед введением флокс кулянта, в культуральную жидкость добавляют окись или гидроокнсь ипи фосфат или сульфат магния или кальция или железа или марганца.При атом для культивирования из микроорганизмов используют микроорганизмы рода Д 1 йаЬас 1 етТаким образом в описываемом способа предусмотрены приемы, обеспечивающие стабильность агрегатов флоккулированных, клеток, в связи с чем они проявляют большую стойкость против уплотнения в процессе культивирования.Улучшение стабильности агрегатов клеток способствует также значительному увеличению скорости течения растворов субстратачерез их слой, что в свою очередь делает возможным вести переработку растворов сравнительно высокой вязкости.П р и м е р 1. В результате культивирования микробиологической культуры Агт.1 тгоЬас 1 ет К Ь 3728 ф на питательной среде получают культуралыуюжидкость, от которой отбирают порциюв 19 л и вводят в нее 716 л 1%-ногораствора Примафлок С(рН которогопредварительно доводят от 5), затем вво.дят 7,7 л 1%-ного раствора. ПримафлокА(рН которого предварительно доведен до 7)Примафлок Си Аявляются катионным и анионным флоккулянтами, поставленными фирмой Ром и Хаас, Филадельфия.После добавления флоккулянтов растворперемешивают 5 минут и флоккулированныеклетки отделяют фильтрованием. Влажныеагрегаты флоккулированных клеток экструдируют и экструдат вйсушивают при 55 С вшкафу с принудительной тягой в течение 1815часов. Высушенный материалразмалывают ипросеивают, отбирают частицы крупностью16 - 20 мкм. Определяют активность изомеразы глюкозы этих частиц, Она составила 62,7 миллиединиц/грамм. Берут вто 20рую порцию культуральной жидкости иобъемом 1 л перемешивают с 60 г окисимагния до увеличения рН от 5,7 до 8,5,Дальнейшую обработку этой смеси ведут35аналогично описанному выше,Отделяют агрегаты крупностью 1626 меш и определяют активность изомеразы их. Она равна 52,1 миллиединиц-грамм,Для проверки твердости агрегатов клетоки определения эффективности описываемо 30го метода применяют прибор для измерениятвердости и сопротивления сжатию полученных частиц.Подлежащие испытанию агрегаты поме 35шают между пластинами прибора, одна иэкоторых выполнена с возможностью пермещения с заданной скоростью в направлении неподвижной пластины. Этим прибором можно измерить усилие, необходимое40для сжатия агрегатов до заданной толщины, например до 0,381 мм, т. е. подвижная пластина не доходит до неподвижнойна 0,38 мм.Было установлено, что скорости тече 45ния растворов субстрата через слой флоккулированных клеток становятся болеестабильными и не уменьшаются по мереувеличения сопротивления сжатию агрегатов флоккулированных клеток.50Для определения твердости высушенныхагрегатов флоккулированных клеток (размером 16-,29 меш) их погружают в водупри комнатной температуре на 4 часа(для набухания), Затем воду заменяют рав 55ным объемом 2 М раствора глюкозы с рН 8,0.Для этого частицы из воды переносятв этот раствор и выдерживают в нем в течение ночи, имитируя тем самым условияв которых агрегаты, находятся при изомеризации глюкозы. Затем иэ числа погруженных в раствор глюкозы агрегатов берут 10 и промокательной бумагой удаляютс них раствор, поспе чегопомещают ицентре пластин (между ними), чтобы агрегаты не соприкасались между собой, и определяют величину сопротивления сжатиюагрегатов.При этом получают, что на сжатиеагрегатов клеток, полученных по предлагаемому способу (с добавлением окисимагния) требуется усилие в 9,5 кг, ана сжатие контрольных - 3,3 кг,Для определения скоростей течениясубстрата через слой агрегатов флоккулированных частиц была проведена кх оценка в условиях непрерывной работы.Для этого 75 г высушенных частицразмером 16-20 меш, полученных приосуществлении предлагаемого способа иконтрольным приемом, было погружено вводу на некоторое время для набухания.Затем материал был промыт 8 л 0,004 Мраствора хлористого магния, содержащего0,1 М раствор бикарбоната натрия в качестве буфера. Промьггые частицы в каждом случае загружали в снабженные рубашкой колонки диаметром 1 дюйм, нагреваомые до 60 С. Через колонки самотекомпропускали 50%-ный по весу раствор глюкозы, и.определяли скорости течения его.Результаты, приведенные в таблице 1, показывают, что флоккулированные клетки,содержащие добавленную окись магния,обнаруживают более замедленное уменьшение скорости течения раствора глюкозы, чем "необработанные (контрольные).Было найдено, что кроме окиси матния эффективными для получения агрегатов флоккулированных клеток )н 1 И 1 ОЬОСЫс увеличенной твердостью является ряддругих соединений,(по определению прибором Инстрон). В табл. 2 показаны результаты, полученные с различными добавками при осуществлении способа Методики. Некоторые соединения, напримеруглекислый магний, хлористый магний иуглекислый кальций, являются неэффективными в случае их использования,при осуществлении описываемого способа.П р и м е р 2. Для оценки эффективности настоящего изобретения способ осуществляют с применением другого микроорганизма, образующего глюкоизомераэу,В этом случае среду (250 мл), содержащую 1% пептона, 0,25 % дрожжевогоэкстракта, 0,5% мясного экстракта, 0,05%семиводного сульфата марганца, 0,5%хлористого натрия, 2% силозы и 0,003 Мхлористого кобальта засеиваюг Я 1 Еф 01 пйуС 66627761 Таблица 1Сравнение скоростей течения раствора глюкозы через слой флоккулнрованныхклеток Ь 1 И гоЬас 1 вф Клетки, флоккулированные Примафлоком Си А, 75 г частиц, 16-20 меш.Клетки, флоккулирэваниые Примафлоком Си А75 г частиц, 16-20 меш. содержат окись магния 340,9 21 1,0 4,8 а 2 ць АТСС 21132. Культивирование ведут в однолитровой колбе на вращающемся столе при ЗЭ"С в течение 48 часов и затем ее используют для посева в 10- литровый ферментатор, аэрируемый со скоростью 2,5 литра воздуха в минуту и перемешиваемый со скорость 200 об/мин. флоккулирование получившейся мвцнлальной суспвнзии, равно как и оценку флоккудн 1рованных агрегатов, производят как описано в примере 1.10П р и м е р 3. МикроорганизмЪОсИць СООфц 1 ОПв засевают на среду, содержащую 1% протеазы пентона, 1% дрожжевого экстракта, 0,8% КНРОи 2% лактозы15 (стерилизованной),рНсреды 6,0,инкубацию проводят при 45 С в течение 48 часов на вращающемся столе. По окончании инкубации добавляют толуол (0,5% от объема) и смесь перемешивают 30 минут. Фдокку 20 пяцию и извлечение аграгатов флоккулированных клеток осуществляют по методике описанной выше ддя 1 Р 1 ЙРОЬОс 1 ЕР за исключением того, что добавляют 4,6 г/л Примафлок Св виде 1,5% но 25 го раствора и затем 1,5. г/л Примафлок Ав виде 1%-ного водного раствора, Оценку флоккулированных агрегатов (частицы 16-20 меш) производят обычным образом, за исключением того, что частицы погружаот в 2%-ный раствор лактозы, имеющей 60 С, а не,2 М раствор глюкозы. Твердость по Инстрону равна 4,6 кг. Испытание активности лактозы этих частиц дало 38,5 единиц на грамм сухого веса.Метод фдоккуляции для Вд сИ ив соаДц Гаити повторяют за исключением того, что окись магния 2,5 г/л добавляют перед флоккудяцией Полученные частицы 12-20 меш имеют твердость по Инстрону 6,0 кг и активность лактозы 26,5 единицНа выбор данной добавки для применения в настоящем изобретении влияют несколько факторов, включая стабильность внзима, оптимальный ддя энзиматического превращения диапазон рН и реакцию микробных клеток надокулянты в присутствик выбранной добавки . Например щелочная добавка, такая как окись кальция, не будет пригодна для применения с энзимом, имеющим максимальную актявность при рН. Конечный выбор добавки зависит от условий фактической работы так, что необходимы некоторыв опыты для: определения оптимального состава. Определения этого оптн мального состава наиболее удобно делать тутем выбора вначале флоккулирующего агента или агентов, а затем оптимального количества их, Эффективность различных добавок при различных уровнях оценивают обычными методамн.Количество добавки, требуемое для полученяя . желаемой твердости, может изменяться от 1 до 12% по весу влажных флоккулируемых клеток. Предпочтительным является уровень от 2 до 6% по весу влажных клеток.627761 78Таблица 2Флоккуляция клеток 411 ЬЮЬас 1 е ЯЯЯ 1, Вв присутствии различныхдобавок с применением флоккулируюпцих агентов Примафлок С 7 и АКонтроль (беэ добавки) 3,3 62,7 ОкисьмагнияГюдроокись магнияКислый фосфат магнияОкись капьция 21,5 10,8 43,1 74 48,4 37,2 Гидроокись кальция 8,0 38,0 Трифосфат кальцияСульфат кальцияОкись марганцаОкись железаУглекислый магнийХлорястый магнийУглекислый кальций 84,6 83,8 40,4 46,8 2,9 89,4 41,3 49,6 Т аблицаЗ 33 Флоккуляшия бЬ ер 1 оиусеб ОИИ 4 Э АТОС 21132 в присутствии раэличиых флоккулирувици агентов и добавокПримвфлок С(13,5 г/лв виде 2,7%-ного водногораствора), затем Примаяок А(4,35 г в виде 2,9%-ного водногораствора) Контроль (беэдобавки) 22,0 12,4 Примафлок С(13,5 г/лв энде 2,7%-ного водного раствора), затем Примафлок А,(4,38 г/л в аиде 2,0%-ного водного раствора Окись магния 40,0 8,85627761 10 Продолжение табл. 3г Контроль (бездобавки) 12,0 6,8 Окись магния 34,0 1,8 Контроль (беэдобавки) 3,2 10,0,Гидроокиськальция 6,5 8,9 1) Катфлок- полиалшцаиметил, аммоний хлорид - катнонный электролит.2) Делфлок 763-катионный полнэлектролит полиамидно эпихпоргндрированноготипа. Формула изобрэтения Источники .информации, принятые вовнимание при экспертизе:1. Патент. СССР Ж 844380,Заказ 5494/8 Тираж 568 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССРпо делам изобретений и открыгий113038, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП фПатент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Катфлок ф (2 8бвз предваритвпьногоразбавления)Катфлок (2,8 мл/лбез предварительногоразбавления)Двпфлок 7631 (2,8 мл/л.без предварительногоразбавления)Депфпок 763 (2,8 мл/лйбвэ предварительногоразбавления) 1. Способ получения агрегата микроЬ- ных клеток, предусматривающий культиви рование микроорганизмов, в жидкой питательной среде, введение флоккулянта в культуральную жидкость для образования агрегатов клеток, отделение полученных агрегатов от культурапьной жидкости, 3 з экструзию флоккулированных клеток с пооледуюшей сушкой, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что, с целью увеличения твердости и стабильности агрегатов клеток, пе 40 ред введением флоккулянта в культуральную жидкость добавляют окись или гидро- окись или фосфат илн сульфат магния или кальция или железа илн марганца.2, Способ,по. и. 1, о т л и ч а юш и й с я тем, что из микроорганизмов культивируют микроорганизм рода Д 1 И оЬас 1 е .