Способ получения амида

, И 124 И 9/06 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТПРИ ГКНТ СССР Ее 82393" %.1 И ОПИСАНИЕ ИЭОБРЕТЕНИ АТЕНТУ астриз Ко.,Масами Окумур У 24279,особам кроорга- гидра- микроор- олучают М вВь ислотам отрицател еправильлегким ро(21) 4011809/30-13(56) Заявка Францикл. С 12 0 13/Об, 1 Изобретение относится к спполучения амидов с помощью минизмов, в частности к способамтации нитрилов под действиемганизмов, в результате чего псоответствующие амиды,Цель изобретения - повьппение выхода целевого продукта.КЬойососсия яр, 8-6 обладает особенно высокой нитрилазной активностьюон депонирован в Исследовательскоминституте ферментации агенства промьппленной науки и технологии министерства международной торговли и промьппленности, Япония, под номеромГЕВМ-ВР У 687.Морфология. Некрупные палочки 0,5 О,В мкм в диаметре и 1-5 мкм в длину,На начальной стадии культивированияклетки имеют удлиненную палочкообраз(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ А 11 ИДЛ(57) Изобретение относится к способам получения амидов с помощью микроорганизмов, более. конкретно к способам гидратации нитрилов под действием микроорганизмов, в результате чего получают соответствующие амиды,Цель изобретения - повышение выходацелевого продукта. Для этого нитрилы,содержащие 2-6 атомов углерода, подвергают воздействию микроорганизмаКЬойососсця яр. 8-6 РЕИ 1-ВР Р 687, об.ладающего способностью гидратироватьнитрилы с образованием соответствующих амидов в водной среде1 табл,ную форму, наблюдается нерегулярноеветвление. Затем они разламываютсярасщепляются на сферические или коркие палочкообразные формы (плеоморфизм) .Подвижность не наблюдается.Образование спор не наблюдается,Окрашивание по Граму положительно (+).Устойчивость к кная (-).Характер роста на различных культральных средах (30 С),Культура на пластинах бульона наагаре: колонии круговые, нные, поверхность гладкая сзовым оттенком,Культура на скошенном агаре: рост оший, поперечное сечение трапеценое, без блеска, слегка розоватая3 151248Культура на жидком бульоне: интенсивный рост во время образованияпелликул, жидкость прозрачна, осадокпо мере роста.Физиологические характеристики,Восстановление нитрата: положительно (+).Разложение мочевины; положитель. но (+).10Выработка индола: отрицательно (-).Гидролиз крахмала: отрицательно (-) .Разложение желатина: отрицательно (-),15Разложение целлюлозы: отрицательно (-).Оксидаза: отрицательно (-),Каталаза: положительно (+).Потребность в свободном кислороде: 20положительно (+),Рост в анаэробных условиях: отрицательно (-),О/Р тест: О,Росу при 37 ОС: положительно (+), 25Потребность в витаминах: отрицательно (-) .Продуцирование газа из глюкозы:отрицательно (-),Продуцирование кислоты из глюкозы: 30положительно (+),Химический состав клеток.Содержит мезо-диаминопимелиновуюкислоту, арабинозу и галактозу,Содержит жирные кислоты С 6(п, Р)35С(Р, ) и С(10-СНз) в качестве основных жирных кислот.Содержит С -С -миколовые кисло 5 ь 46ты в качестве типа миколовых кислот.Штамм Я-б определяют как бациллу, 40которая является грам-положительной,отрицательной по спорообразованию, аэробной, обладающей полиморфолизом иотрицательной устойчивостью к кислотам.45Этот штамм. включает в себя мезодиаминопимелиновую кислоту, арабинозу и галактозу, С б (п,Р), С 18 (Р )и С,з (10-СН) в виде жирных кислот иС -С -миколовые кислоты в виде мйкоы м 50ловой кислоты,На основании приведенных бактериологических характеристик настоящий штаммидентифицирует как бактерию, принадлежащую к роду Иойососсцз,При культивировании микроорганизмов по предлагаемому способу используют обычную культуральную среду, содержащую источник углерода (например,8 4глюкозу,глицерин и мальтозу),источниказота (например, сульфат аммония и хлористый аммоний) и источники органическихпитательных веществ (например, дрожжевойэкстракт,пелтон,мясной экстракт,соевый протеиновый гидролизат и жидкостьпосле замачивания кукурузы (СБЕ), источник неорганических питательныхвеществ (например, фосфат, магний,калий, цинк, железо и марганец) и т,д,Такое культивирование проводят в аэробных условиях при перемешиваниипри рН 6-8 и 20-35 С, предпочтительно 25-30 С, в течение 1-3 дней,На практике при осуществленииспособа один из штаммов, выбранныйиз указанных микроорганизмов, культивируют в течение 2-3 дней указанным способом, а полученные культурыили клетки выделяют из культуры илиобработанные клетки (неочищенные ферменты, иммобилизованные клетки ит,д,) суспендируют в воде, буфере илифизиологическом солевом растворе, азатем добавляют нитрильное соединение,Нитрильное соединение воздействуетна клетки при взаимодействии с воднойсредой, обычно содержащей от около0,01 до 10 вес.% клеток и от около0,1 до 10 вес,Х нитрильного соединения, при температуре от ее точки замерзания до 30 С, предпочтительно7-9, в течение 0,5-10 ч,Нитрильные соединения, используемые1в качестве субстрата, являются биологически очень токсичными и оказывают вредное воздействие на ферментнуюреакцию. Поэтому нитрильное соедине.ние добавляют постепенно, контролируя, чтобы концентрация нитрилов всистеме предпочтительно не превышала2 вес.Х.Если рН находится за пределамиуказанного интервала значений, образующийся и накапливающийся амид далеегидролизуется и стабильность клетокпонижается, Поэтому предпочтительноконтролировать значение рН в интервале 7-8 путем постепенного добавления каустика (например, ИаОН и КОН)или путем предпочтительного добавленияк системе буфера,Если условия реакции контролироватьсоответствующим образом, целевой амидможно получить и выделить из нитрильного соединения с конверсией приблизительно 100 Е и практически без образования побочных продуктов, 1512488Образовавшийся амид можно выделитьиз реакционной смеси обычными способами, например клетки выделяют из реакционной смеси с помощью центрифу 5ги, обработкой активированным углемили ионообменной смолой и т,д., а затем концентрируют при пониженном давлении до получения целевого амида,например акриламида. 1 ОРазличные нитрилы и соответствующие им амиды количественно анализируют с помощью газовой хроматографии,а соответствующие им органические кислоты - с помощью высокоэффективнойжидкостной хроматографии,П р и м е р 1. Штамм Юодососсцяяр, Я-б культивируют в аэробных условиях на среде (рН 7,2), содержащейвес.Е: глюкоза 1, пептон 0,5, дрожжевой экстракт 0,3 мясной экстракт 0,3при 30 С в течение 48 ч. Образующиесяпри этом клетки выделяют с помощьюцентрифуги и промывают 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,7), Эту процедуру 25повторяют до получения промытыхклеток штамма Я-б (содержание,воды 80 Х),Приготавливают смесь 0,5 вес.ч,промытых клеток и 84,5 вес.ч. 0,05 Мфосфатного буфера (рН 8,5), а затем15 вес,ч. акрилонитрила добавляют поочастям при перемешивании при 0-3 С,контролируя условия таким образом,чтобы концентрация акрилонитрила в ре.акционной системе не превышала 2 Е,т,е. не подвергая акрилонитрил реакции гидратации, Добавление акрилонитрила завершают примерно через 3 ч.Для обеспечения завершения реакции 40перемешивание продолжают еще в течение нескольких часов.,Затем клеткивыделяют с помощью центрифуги до получения прозрачного раствора. Этотраствор содержит, 20 Еакриламида, выход акриламида превышает 99,9 Е,Непрореагировавший акрилонитрил вовсе не. детектируется, а содержание побочныхпродуктов акриловой кислоты не превышает 0,1% (в расчете на вес акриламида).Воду отгоняют из прозрачного раствора при температуре не более 50 С,прозрачный раствор концентрируют доосаждения кристаллов. Эти кристаллыперекристаллизовывают из метанола дополучения бесцветных пластинкообразных кристаллов. Это соединение оп ределяют как акриламид на основании5 10 10 2.,0 температуры плавления, элементногоанализа и данных ИК,П р и м е р 2. Промытые клеткиштамма Б-б получают так же, как в примере 1, и определяют их реакционнуюспособность по отношению к различным нитрилам в следующих условиях.Условия реакции;Нитрильное соединение, Х 2,5Калийфосфатный буфер (рН 7,7), М 0,05Клетки (в видесухих клеток),мгоТемпература, СВремя реакции,минКоличество реакционного раствора, мл 10Результаты реакции приведены втаблице.П р и м е р 3. 100 мл культуральной среды, содержащей вес.7: глицерин 1, КН РО+ 0,1, МАМБО 7 Н О 0,05,ГеБО 7 НО 0,001, соевый белковыйгидролизат 0,5, дрожжевой экстракт(рН 7,5) О, 1, который стерилизуют ик которому добавлено 0,57. стерильногоизобутиронитрила, приготавливают вЭрленмейеровской склянке емкостью500 мл. Затем добавляют 1 мл культуры типа культурального штамма, которую культивируют в течение 48 ч втакой же культуральной среде, что ив примере 1, и культивирование ведутпри вибрации при 25 С в течение 48 ч.После завершения культивирования клет"ки выделяют с помощью центрифуги,а затем промывают 0,05 И фосфатнымбуфером (рН 7,7), Эту процедуру повторяют до получения промытых клеток.Определяют активность этих клетокпо образованию акриламида из акрилонитрила так же, как в примере 2.Полученные результаты:Тип штамма Активность приобразованииакриламида,мкМ/мгчЙпойососсця сгусЪторо 1 хя 1 РМ 155 3,5Юойососсця гЬойосЬгоця 1 РМ 153 2,5АгтЬгоЪасгег охуйапя1 ГО 12138 5,0АггпгоЪасгет ацгеясепя ХАМ 12340МсгоЬасгегцш:Я 1 ачцш 1 АМ 1642 2,01512488 Формула изобретения 10 10 12 3 11 16 отношению к акри Относительное значение итрилу в качестве 100 Л.Пата оставитель И.Та ехред Л.Сердюко С рееваРедактор Л,Огар Т ва 1(ор Заказ 5914/59 Тираж 01 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 одственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. агарина,101 П Способ получения амида путем биотрансАормации нитрила штаммом бактерий в буАерном растворе при постоянных рН и температуре, о т л и ч а юЛцетонитрилПропионитрилЛкрилонитрилМетакрилонитрилБутиронитрилВалеронитрилНикотинонитрил щ и й с я тем, что, с целью повышениявыхода целевого продукта, биотрансФормации подвергают нитрил с 2-6атомами углерода, а в качестве бактерии используют штамм КЬооососсцвзр, 8-6 РЕБМ-ВР Р 687,