Способ определения активности простагландин-синтетазы в тромбоцитах

(9) 1 Б 33/68 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ и о ндинений, облад янием на акт перекисных соеингибирующим влПГ- си нт ет азы; Изобретеничастности к относ к медицине ость линическои биохимии,пользовано для опрести простагландин (ПГ) -мбоцитах (ТЦ).ения - повышение точкубацию проводят ввиях при рН 7,4 дляа ПГ изолированнымиПГ отделяют колои может быть иделения активнсинтетазы в трЦель иэобре птимапьньовышенияЦ; образочной инт анн еагиафиеи от непро ата для устра ения хроматог меченой АК. мато субс хр го вав ния Аифоновогческой гряз тинк едующим Способ осуобразом.Кровь отбипробирки с.(иэ расчетажашим 85 мМлимонной ки ествля пластиковые буфером рН 4,5 ъему), содернатрия, 65 мМмМ декстрозы. ов и эритроцитов цитратным 1:9 по о цитрата слоты и 5 я лейкоциГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ С 8 ИДЕТЕЛЬСТ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОСТАГЛАНДИН-СИНТЕТАЗЫ В ТРОМБОЦИ ТАХ(57) Изобретение относится к медицне, в частности к клинической биохимии, и может быть использованодля определения активности простагл ности и чувствительности способа.Цель достигается тем, что взятие крови проводят с цитратным буфером рН 4,5 и обогащенную ТЦ плазму доводят до рН 6,5 для повышения устойчивости ТЦ к процедурам выделения; вводят временной интервал выдержки ТЦ (не менее 1 ч ) для восстановления их реакционной активности; непосредственно перед инкубацией про водят колоночную хроматографию для очисткиС 1 арахидоновой кислоты 1,АКт образующихся при хранении дин-синтетазы в тромбоцитах. Цель изобретения заключается в повышени точности и чувствительности способа Сущность изобретения состоит в том1 что для определения активности прос агландин-синтетазы тромбоциты нз кр ви вьщеляют в цитратном буфере при рН 6,5, выдерживают в течение 1 ч, предварительно проводят очистку 4 Сарахидоновой кислоты с помощью хроматографии на кремниевой кислоте, инкубируют ее с тромбоцитами при рН 7,4, а перед определением радиоактивно меченых простагландинов про водят разделение продукта от непрореагировавшего субстрата с помощью хроматографии на кремниевой кислоте. 2 табл.3 1 Ы 6358 кровь центрифугируют в течение 1 О мин при 200 8. Обогащенную ТЦ плазму переносят в чистые пробирки, подкисляют 0,15 М лимонной кислотой до рН 6,5 (0,025 мл на 1 мл плазмы)и центрифугируют в течение 10 . н при 1000 , Осадок ТЦ ресуспендируют в модифицированном Тирод-Хепес-буфере рН 6,5 (137 мМ ЮаС 1 268 мМ КС 1; 0,46 мМ О КН Р 04, 1 мМ МС 1, 5 мМ декстрозы, 10 мМ НЕРЕЯ 1 0,353 БСА 50 ед/мл гепарина; 0,05 мг/мл апиразы). ТЦ повторно осаждают при 800 я в течение 10 мин, ресуспендируют в безкальцие вом Тирод-Хепес-буфере рН 7,4 без БСА, гепарина и апиразы (в 1/5 от исходного объема) и осуществляют просчет ТЦ под микроскопом или с помощью соответствующего гематологи ческого анализатора, Исследонание проводят не ранее чем через 60 мин после получения конечной суспензии ТЦ (,примерно через 2,5 ч с момен:а взятия крови ). В день проведения 25 эксперимента соответствующее количество фСАК выпаривают под азотом, растворяют в 0,1 мл хлороформа (хлф) и наносят на колонку, заполненную 0,5 г кремниевой кислоты (;00-200 меш)30 н 1,5 мл хлф " САК, количественно элюируют 7 мл хлороформа, выпариннмт под азотом и растворяют н таком количестве 0,05 Й Трис-НС 1-буфе" ,р 1 8 ), чтобь. получить 5 нмоль АК в 0,05 мл буфера. Инкубапию проводят в течение 1 О:ин при 37 С, концентрации ТЦ 210 , АК 5 мкМ в объеме 1 и, Реакция начинается с момендс.банления " С, АК, идет при пос тояннсм переь(ешигании и останавливаетс., добавлением охлажденной на льду смеси хлф: метанол; 17. муравьиная кислота (1,2;1,2:0,1) из расчета 2,5 объема на 1 объем реакционной смеси. Нижнюю хлф, фазу выпаривают лод азотом и растворяют в О, мл хлф. В к:.честве контроля проводят инкубацию дСАК (5 мкЮ н отсу-ст-.сии ТЦ. Хлф. экстракт (0,1 мл) наносят на колонку с кремниевой кислотой. Сначала элюируют непрореагироьавшую и С) АК 7 мл хлф, а затем с С 3 ПГ 5 мл20 ного метанола н хлй, Сконцентрированный под азотом элюат ПГ нано 55сят на хроматографическую пластинку"811 ц 2 о 1" (ЧССР) совместно со стандартными ПГ - тромбоксан В, (ТХВ)ПГЕи ПГР и разделяют в системе4 диэтиловый эфир:метанол:ледяная уксусная кислота (90:1:2).Пятна на пластинках, соответствующие стандартным ПГ, проявляют в парах иода, вырезают и помещают в сцинтилляционные флаконы. После экстракции ПГ метанолом добавляют сцинтилляционную жидкость и просчитывают радиоактивность на р-счетчике. Активность ПГ-синтетазы оценивают по количеству нмоль ПГ, синтеэируемых ТЦ из меченого субстрата за 10 мин инкубации, в расчете на определенное количество ТЦ (10).П р и м е р 1. 12 мл крови смешивают с 1,1 мл цитратного буфера рН 4,5 и центрифугируют в течение 10 мин при 200 я. В чистые пробирки переносят 3 мл обогащенной ТЦ плазмы, добавляют 75 мкл 0,15 М раствора лимонной кислоты и центрифугируют при 1000 я в течение 10 мин. Осадок ТЦ ресуспендируют в 1 мл Тирод-ХепесбУфера рН 6,5 (с гепарином, БСАапиразой) с последующим доведениемо 3 мл. ТЦ повторно центрифугируют при 800 а в течение 1 О мин, ресуспендируют в 0,6 мл Тирод-Хепес-буфера рН 7,4 и 40 мкл суспензии отбирают цля просчета концентрации ТЦ на гематологическом анализаторе "СЕШ 1-Дин" Э (Италия). После разбавления пробы 160 мкл физиологическим раствором получают в 1 мл анализируемого раствора 2,9 10 ТЦ. Из флакона с исходным8 раствором сС 1 АК (54,9 мКл/ммоль) в стеклянную силиконированную пробирку отбирают 11 мкл кислоты, вы паривают под азотом, растворяют в 0,1 мл хлф и наносят на колонку с 0,5 г кремниевой кислоты (100-200 меш. В.о Кад 1,аЪ. США), суспендированной в 1,5 мл хлф (" САК, элюируют 7 мл хлф , 0,1 мл элюата отбирают в сцинтилляционный флакон, выпаривают, добавляют 1 О мл сцинтилляционной жидкости ЖС. После просчета радиоактивности получают 34 800 раси/мин. С учетом этих данных оставшийся хлф. элюат выпаривают под азотом и растворяют в 1,97 мл 0,05 М Трис-НС 1. Для проведения реакции в пробирку добавляют 0,138 мл суспензии ТЦ (210 8 ТЦ) 0,812 мл 0,05 М трис-НС 1 буфера рН 7,4. После помещения в водяную баню (37 С) вносят 0,05 мл 4 САК (5 нмоль) и через 1 О мин 2,5 мл охлажденной смеси хлф;метанол 17-ная му(нмоль на10 ТЦ) ПГ мин Опыт Конт 5 15063 равьиная кислота в соотношении 1,2: 1,2: :0,1. Для контроля проводят инкуба цию с САК в отсутствии ТЦ. Нижнюю хлф.фазу выпаривают под азотом1 растворяют в 0,1 мп хлф. и наносят на колонку с кремниевой кислотой ( 0,5 г), суспендированной в 1,5 мп хлф. Непрореагировавшую 1"С- АК элюируют 7 мл хлф, а ПГ - 5 мл 207. - ного метанола в хлф. Выпаренную до 0,05 мп ПГ фракцию наносят на хроматографическую пластинку 811 иГо 1 (1515 см, ЧССР) вместе с ПГЕ, ПГР и ТХВ(по 10 мкг каждого). Пластин ку помещают в хроматографическую камеру с 50 мп системы растворителей диэтиловый эфир: метанол: ледяная уксусная кислота (90:1:2) и после трехкратного хроматографирования вы сушивают и проявляют в парах иода. Получены следующие значения К 1 для ТХВ 0,64; ПГЕ 0,33, ПГР 0,23. Пятна на пластинке, соответствующие стандартным ПГ, вырезают, поме шают в сцинтилляционные флаконы н после экстракции ПГ 0,1 мл метанола добавляют 10 мл сцинтиллятора ЖС.11 росчет радиоактивности проводят на р-счетчике "Маг 1 с" (Нидерланды). 30 После соответствующего пересчета идентифицированной радиоактивности (распады в мин) в активность ПГ-син - тетазы (нмоль ПГ на 10 Т 1 ) получили следующие данные, представленнь;е в табл.1,58 6синтезирующего фермента в ТЦ. В конт"рольном опыте получены дюновые значения радиоактивности (не выше80 расп/мин), что соответствует количеству ПГ не более чем 0,003 нмоль на10ТЦ и входит в ошибку разброса, результатов данного опыта. П р и м е р 2, Выделение изоли"рованных ТЦ и очистку меченого субстрата осуществляют по примеру 1, снижая при инкубации рН до 7,0 (используют те же ТЦ и Р С 3 - АК). В реакционную пробирку добавляют 0,138 мпсуспензии ТЦ (пример 1 ) и 0,812 мп0,05 И Трис-НС буфера рН 7,0. Пос-.ле помещения в водяную баню ( 37 С)вводят 4 С 3 АК и через 10 мин2,5 мп охлажденной смеси хлф:метанол:1%-ная муравьиная кислота (1,2::1,2-0,1). Последующие процедурыэкстракции, очистки образованных ПГот непрореагировавшего субстрата,разделения метаболитов ТСХ и просчетрадиоактивности проводят по примеру 1, Активность ПГ-синтетаэы в этихусловиях равна 1,67 нмоль ТХВ 1 на0 ТЦ (44533 расп/мин радиоактивности в соответствующем пятне хроматографической пластинки ), что состав"пяет 6,7 Б от количества добавленногосубстрата. Небольшое 1 на 207 ) сни-.жение активности ПГ-синтетазы ТЦ прирН 7,0 связано со смещением оптимального для работы этого фермента рН7,4 в сторону преимущественного образования в ТЦ липооксигенаэногоиетаболита АК, С уменьшением рН инкубационной среды с 7,4 (пример 1)до 7,0 отмечается незначительное снижение синтеза и других ПГ;Ес 0,21до 0,17 и Р , с 0,08 до 0,07 нмольна 10 ТЦ,роль45 ТХВ55838 80 ПГЕ 5622 64 ПГРс, 2098 67 2,09 0,2 0,08 50 Таким образом, изолированные ТП превращают 4 С- АК главным образом в ТХВ ( 2,09 нмоль на 1 О ТЦ, 8,43 от количества добавленного субст. рата или 88 Ж от общего образования ПГ ) и небольшие количества ПГЕ и ПГР , (0,33 и 0,07 нмоль на 10 ТЦ соответственно), По образованию ТХВ, как основного метаболита АК в Т 1 следует судить об актиьности ПГ -П р и м е р 3, Выделение ТЦ и инкубацию сСЛК проводят по примеру 1. При этом используют те же ТЦ, но неочищенную от примесейС АК (2,75 мкл исходного раствораС АК добавляют при инкубации в опытную и контрольную пробы ), Условия проведения инкубации, последующая экстракция и ТСХ анапогичны описанным.в3примере 1, Перед проведением ТСХ не проводят очистку образованных ПГ от непрореагировавшего субстрата,Полученные данные представлены в табл.1506358 Таблица 2 АктивностьПГ-синтетазы,нмоль на 10ТЦ Количество ПГ распадов в минКонтроль Опыт 1,43 0,32 0,06 ТХВ 3546 226 ПГЕ 6917 149 ПГГ 198309 Формула из обретения Составитель А. СкуратТехред М,Пидык Корректор Э, Лончакова Редактор А. Козориз Подписное Тираж 789 Заказ 5423/46 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 В контрольном эксперименте при отсутствии очистки образующихся ПГ от непрореагировавшейС 3 АК в11зонах хроматографической пластинки, соответствующих стандартным ПГ (ТХВ, 20 ПГЕи ПГР ),отмечены повышенные значения радиоактивности по сравнению с соответствующими значениями в контрольном опыте примера Р 1. Это указывает на фоновое загрязнение радиоактивным субстратом, проходящим через всю пластинку с фронтом растворителя и вносящим погрешность в измерение ПГ. В условиях данного эксперимента выявлено примерно 307. сньскение синтеза ТХВ (по сравнению с соответствующими зйачениями в примере 1 ), что связано с использованием неочищеннойС 1 АК, образующей при хранении перекиси, подавлякщие активность ПГ-синтетазы, Некоторое увеличение синтеза ПГГ(на 163) может быть мнимым, так как уровень образования этого Пг достаточно низкий, и может быть обусловлено присутствием примеси непрореагировавшего субстрата.Использование предлагаемого способа позволяет определять активность ПГ-синтетазы с точностью до 952 и чувствительностью не менее 1 нмоль анализируемых ПГ. Кроме этого, разброс показаний составляет менее 107 за счет использования интактных ТЦ и проведения инкубации в оптимальном для фермента режиме работы. Способ определения активностипростагландин-синтетазы в тромбоцитах, включающий выделение тромбоцитов, инкубацию (11 С 1 арахидоновой:кислоты, экстракцию и тонкослойнуюхроматографию с последующим определением радиоактивности в зонах, соответствующих стандартным простагландинам, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения точности ичувствительности способа, тромбоциты из крови выделяют в цитратномбуфере при рН 6,5, выдерживают в течение 1 ч, предварительно проводяточистку14 С 1 арахидоновой кислоты спомощью хроматографии на кремниевойкислоте, инкубируют ее с тромбоцитами при рН 7,4, а перед определениемрадиоактивно меченых простагландинов проводят разделение продукта отнепрореагировавшего субстрата с помощью хроматографии на кремниевойкислоте,