Способ лечения вирусных инфекций

(56) Заявка ЕР ение естественных противовирускций и крепления иммунной систекализованных отделах организма. В е иммуномодулятора используют ты двунитчатой РНК с неправильзыванием, представляющий собой с полиинозината и полицитидилатэ, ащий от 1:5 до 1:30 урациловых нидиновых оснований формулы 12-14 Ч) или гп(С 29, 6)п и вводят его ,1-1000 мкг на 1 мл. Способ позвовысить резистентность организма к й инфекции. 1 табл.- повыш ных реа мы вло качеств препара ным свя ком плек соде рж или гуа Г 1 пг(С в дозе 0 ляет по вирусно л. й. 30(57) Изобретениможет быть исптественных защ Нложения. Более того, скорость восстановления нормального состояния с помощью двуниточной РНК может быть ускорена посредством предварительного воздействия лимфокинами.Двуниточные РНК представляют собой синтетические полинуклеотидные комплексы, включающие по две парные нити, Под двуниточной РНК с неправильным связыванием подразумеваются такие кислоты, в которых водородные связи (упаковка оснований) между парными нитями являются сравнительно неповрежденными, т,е. прерывание имеет место в среднем в одной паре оснований на каждые 29 последующих групп, Неправильное связывание есть нарушение нормальной геометрической конфигурации двойной спирали РНК за счет провисания нитей внутрь (или наружу), Эти участки представляют собой точки повышенной чувствительности двуниточной РНК к биологической обработке рибонуклеазами. Следует правильно понимать термин нук зыв кин ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) Инк (5)Картер (ОЯ)28224 А 2, 1987.ЕЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ е относится к медицине и ользовано для активации еситных сил организма. Цель Изобретение относится к медицине и может быть использовано при лечении инфекционных заболеваний.К числу новейших продуктов, которые могутсыграть решающую роль в борьбе с инфекционными и раковыми заболеваниями, относятся так называемые иммуномодуляторы такие, как интерфероны, интерлекины и фактор некроза опухоли. Они представляют собой белкосодержащие лекарственные средства, которые способны активизировать естественные защитные силы организма.Цель изобретения - повышение естественных противовирусных реакций и укрепление иммунной системы в локализованных отделах организма человека,Способ осуществляется следующим образом,РНК с двойной нитью, особенно рибоеиновые кислоты с неправильным свяанием, восстанавливают нормальную тику рибонуклеазыи продуктов разК 37/10, 31/155, 31/5"двуниточная РНК с неправильным связыванием",Двуниточная РНК может представлятьсобой комплекс полиинозината (поли 1) иполицитидилата (поли С), содержащийурациловые (У) или гуанидиновые (6) ос-нования в определенных соотношениях,например, от 1:5 до 1:30 таких оснований(полиС 4-29 хЧ или 6).Двуниточная РНК может иметь общую формулуги(С 11-14Япили гп .(С 12ЯпЗначение и меняется от 4 до 29, Другиеподходящие примеры двуниточной РНКрассматриваются далее,Основу двуниточной РНК с неправильным связыванием, использование которыхявляется предпочтительным в соответствиис предлагаемым изобретением, составляютсополинуклеотиды, выбираемые иэ поли(Сп, О), где и - множитель, принимающийзначения от 4 до 29. Эти РНК являются аналогами комплексов из полирибоинозиновойи полирибоцитидиловой кислот, образующимися путем модификации ги Сп в целяхвнедрения непарных оснований (урациловых или гуанидиновых) вдоль полирибоцитидилатной нити (гСп), Альтернативнымспособом получения двуниточной РНК является модификация основной рибосильнойнити полирибоиноциновой кислоты (ги), например, эа счет включения 2-О-метилрибосильных групп, Эти аналоги соединенияги г Сл, имеющие неправильное связывание, являются предпочтительными. Те изних, которые отвечают формулам гиг(С 1114, Ч)п и гп г(С 29, О)п, описаны Картером иТоу в патентах США М 4130641 и М4024222, упоминаемых здесь в форме ссылокна источник, Описанные в этих патентах двуниточные РНК, вообще говоря, пригодныдля использования в соответствии с предлагаемым изобретением.В предпочтительной модификации РНКс неправильным связыванием формулыг,(С 12,Ч)п область, включающая непрерывный участок иэ 6-12 пар оснований; т.е. длиной от половины до полного витка спиралиРНК, служит в качестве биотриггера, вызывающего выделение лимфокинов и в качестве внеклеточного софактора ферментов,участвующих ва естественных противовирусных реакциях. Области неправильногосвязывания, состоящие из урацильныхгрупп, внедрены с определенной периодичностью в полипиримидиновую цепочку дляускорения гидролиза РНК и устранения таким образом токсичности,Другими примерами возможных модификаций двуниточных РНК с неправильным10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 связыванием, пригодных для использования в соответствии с предлагаемым изобретением, являются:поли , поли (С 4, Ч)поли , поли (С 7, Яполи , поли (С 1 з, Яполи , поли (С 22, /)пОли , пОли (С 20, 6)пОли , пОли (т 29, 6)поли , поли (Ср/23 Ср)Обычно вводимые дозы двуниточной РНК составляют 0,1-1000 мкг на 1 мл жидкости в теле пациента. Термин "изолированная жидкость тела" относится к раствору сывороточной жидкости, солей. витаминов и т,п., который циркулирует в организме, омывая ткани, Объем жидкости в теле пациента определяются по имеющимся медицинским таблицам, которые содержат сведения о взаимосвязи веса реципиента с объемом содержащейся в его или ее теле жидкости. Эта величинаа представляет собой суммарный объем содержащейся в теле пациента жидкости, который и является тем объемом, который используют для установления необходимого для сохранения равновесия количества РНК с двойной нитью. Например, в теле пациента весом 60 или 70 кг содержится примерно 5-6 л жидкости. При использовании обоих агентов (двуниточная РНК и лимфокин) их можно вводить в виде смеси. раздельно, но одновременно или раздельно в определенной последовательности.К введению двуниточной РНК и лимфокина "в комбинации" относятся случаи, когда агенты вводятся вместе в виде терапевтической смеси, а также те процедуры, при которых два агента вводят раздельно, но одновременно, например, одному и тому же пациенту по разным внутривенным путям. Способ введения "в комбинации" также включает раздельное введение лекарств, при котором сначала вводят одно, а спустя короткий промежуток времени - другое лека рстве н ное средство.П р и м е р 1. Вводят образцы двуниточной РНК с неправильным связыванием, представлявшей собой двуниточную РНК с неправильным связыванием общей формулы ги г(С 12, Ч) в количестве 20-1000 г еженедельно группе лиц весом 40-70 кг и проводил анализ их сывороточных жидкостей, в частности, влагалищных секреций и мужского эякулята на присутствие в них индуцированных двуниточных РНК защитных медиаторов реципиента. В ходе групповых клинических испытаний изучались аналогичные параметры на индивидах, которым было проведено вливание их интерферонов5 10 20 25 30 35 40 45 50 или интерлейкинов, с целью выявления специфики процессов. если это имело место, С помощью световой микроскопии было установлено, что жидкость. взятая у пациентов, которым были сделаны вливания, содержали различные клетки, в т.ч, мононуклеарные, клетки сквомозного эпителия (образцы иэ жестких половых органов) и сперматозоиды (мужская семенная жидкость), а также аморфную массу клеточных "остатков", В ниже- расположенной таблице приводятся обобщенные результаты наблюдений за тремя пациентами при лечении их с помощью двуниточных РНК с неправильным связыванием в течение различных периодов времени.В случае пациентов А и В отмечены высокие титры вируса иммунодефицита человека (Н Ч-) иэ эякулятов, Измерения проводили при обьеме эякулятов 2,0-4,0 см с помощью сокультуры. Для этого брали мононуклеарные клетки крови обычного донора, который подвергался стимуляции с помощью фиттогемагглютинина в течени 2- 4 дней, и выращ, вали культуру в течение 28 дней, а затем проводил измерения на присутствие внеклеточного вируса, методом иммуносорбентного анализа с ферментной меткой, Титр сокупьтуры определяли по средней оптической плотности (оптическая плотность при 490 нм) образца для иммуносорбентного анализа после вычитания отрицательного контрольного значения (менее 0,1). У пациента С отмечено хроническое проявление вируса простого герпесэ во влагалищных секрециях, связанных с формированием периональной визикулы. Вирус простого герпеса культивировали по способу Раппа с использованием конфпуентных клеток НЕ, репродуцированных в питательных слоях чашки Петри толщиной 33 мм,Анализ образцов жидкости пациента с помощью жидкостной хромотографии при высоком давлении после системного введениядвуниточной РНК показывает, что произошло увеличение количества защитных медиаторов реципиента. Влагалищные и семенные жидкости пациентов анализировали на наличие различных компонентов естественной (2 - 5 - олиго А/рибонукпеаээ А) противовирусной реакции в соответствии с ранее описанным мною применительно к периферическим мононуклеа рным.клеткам крови.Для оценки специфичности процесса проводили исследования на подобных пациентах (или животных), котрые проходили лечение высокими дозами (10 млн, ВЧй/) различных интерферонов и интерпекинов. Однако в этих случаях не удалось обнаружить увеличения количества участвующих в борьбе с болезнью медиаторов в изолированных жидкостях, При комбинированном системном введении лимфокинов и двуниточной РНК с неправильным связыванием скорость выявления медиаторов в этих изолированных жидкостях значительно возросла, Жидкостная хроматография при высоком давлении в сочетании с методами радиационного связывания и радиоимунного анализа репродуцированной РНК подтвердила такую специфическую особенность, как выработка во всех частях тела нового 2-5-олигоэденилата в результате применения двуниточной РНК, причем в количествах, достаточных для защиты организма от болезни.Идентификацию методом жидкостной хромотографии при высоком давлении проводили после подготовки образца с использованием трихлоруксусной кислоты и ацетонового осаждения. Использовали аналитическую колонку Уотерса "Са микрон Бондапак", при этом создавали градиенты метанола и воды в буферном растворе из фосфагата аммония (50 мл) при рН 7.0. Тест, проводившийся с помощью метода жидкостной хромотогрэфии, соответствует стандартной калибровке с аутентичными РзАз и РзА 4, которые были синтезированы ферментативным путем. На графике резко выделяются те пики, которые появились при проведении .жидкостной хроматографии в соответствии с данной схемой через 6,87,0 мин или через 12 мин, поскольку именно они указывают на наиболее активные медиаторы, в частности соответствующие аутентичным РзАз и РзА 4, являющихся соответственно тримером и тетрамером 2-5 олигоаденипатных медиаторов.Обнаруживается, что механизм, обусловивший эти явления в локализованных отделах организма, включает, по крайней мере, частично сигнальный трансдуктивный процесс, в ходе которого двуниточная РНК действует на окружение клеток или стенки расположенного вблизи кровеносного сосуда, вызывая волнообразный процесс включения формирования медиаторов в самой локализованной секции.Изобретатель установил, что уникальная структура двуниточной РНК с неправильным связыванием является наиболее благоприятнойдпя практического испопьзования в качестве обьекта изобретения, Это обусловылено тем фактом, что неправильное связывание в РНК с двумя нитями приводит к образованию слабых областей в относительно стабильном в остальной частикомплексе. Результатом этого является то, что маленькие биоактивные фрагменты двуниточной РНК, будучи более мобильными, получают доступ к специализированным отделам организма, обуславливая проявление в них локального высокоспецифичного иммуномодуляторного и противовирусного эффекта. Опыт свидетельствует о том, что получение доступа к другим изолированным отделам не является свойством большинства экзогенно применяемых двуниточных РНК.С целью подтверждения предположения о том, что новые молекулярные разновидности двуниточной РНК, образующиеся в процессе биоразложения, способствуют созданию требующегося высокого уровня медиаторов естественной защитной системы (например, системы 2-5 А) в различныхбиологических жидкостях (жидкости в теле 10 20 пациента), проводили эксперименты как влабораторных условиях, так и на живом организме., А. Сравнение разложения поли, поли Си двуниточной РНК с неправильным связыванием под действием нуклеазы.Чувствительность двуниточных РНК кгидролизу нуклеазной изучалась с помощьюрадиоактивных поли 1, поли С и двуниточных РНК с неправильным связыванием. Полиинозиновая кислота (8- С) (спектральнаяаактивность 3,6 мк кюри (мкмоль) была куплена у фирмы "Р-Брокемикалз", Эта маркированная полиинозиновая кислота имелаболее 1000 оснований по длине молекулы, 35Полиинозиновую кислоту (8- С) смешивалицс немаркированными поли 1, поли С илидвуниточной РНК с неправильным связыванием, смесь подвергали тепловой денатурации и реданатурации с получением 40радиоактивных двуниточных РНК,В первоначальных исследованиях определяли расщепление нуклеазой Я 1 (Е.С,3.1.30. 1), Нуклеаза 5 расщепляет нуклеиновые кислоты с одной нитью, оставляя 45сдвоенные области неповрежденными, Расщепление с помощью нуклеазы 51 поли 1,поли С имело монофазнывй кинетическиймеханизм, при этом скорость генерирования двуниточной РНК трихлоруксусной кислоты достигала 1,4; в минуту. Послетепловой денатурации скорость гидролизаувеличивалась до 1,8;(, в минуту.Аналогичные эксперименты с использованием маркированных двуниточных РНК с 55неправильным связыванием продемонстрировали, что в этом случае кинетический механизм был бифаэным, Исходнаядвуниточная РНК с неправильным связыванием имели быстро разлагающийся компонент (3,2 в минуту), за разложением которого следовала фаза расщепления боле медленно разлагающегося компонента (0,5 в минуту). Денатурированная двуниточная РНК с неправильным связыванием разлагалась сравнительно быстро (4,5 в минуту),Степень общего разложения исходных поли. поли С и двуниточной РНК с неправильным связыванием спустя 45 мин, после начала эксперимента была примерно одинаковой. Как сообщалось ранее, скорость гидролиза двуниточной РНК с неправильным связванием изначально была больше, чем поли, поли С. Однако двухфазный кинетический механизм расщепления двуниточной РНК с неправильным связыванием свидетельствует о явном физическом различии между этими материалом и хорошо фиксированными (полностью спаренными по основаниям) молекулами поли, поли С. Результаты указывают на наличие существенного отличия во вторичной и третичной структурах, которое приводит к неодинаковой чувствительности этих двуниточных РНК к нуклеазе и обуславливает получение неожиданных биологических результатов, описанных в предлагаемой патентной заявке. Кроме того, значительное, т.е, шестикратное уменьшение скорости гидролиза компонентов определенной двуниточной РНК во второй фазе по сравнению с первой и сравнительно слабый гидролиз медленно расщепляющегося компонента указывают на то, что в двуниточных РНК этого типа существует ядро, обладающее относительной стойкостью по отношению к нуклеазе. Это не имеет места в случае поли 1, поли С,Разложение двуниточной РНК с неправильным связыванием под действием нуклеазы проводили с использованием стандартной тканевой питательной среды. (ЯРМ 1640), дополненной дезактивированной теплом сывороточной жидкостью эмб.риона теленка или человека в количестве 10 фД. Эта.сывороточная жидкость является источником рибонуклеаз. Разложение двуниточной РНК с неправильным связыванием в этой среде происходило быстро, примерно 40, этой двуниточной РНК дало растворимую трихлоруксусную кислоту в течение 3 мин, При дальнейшем расщеплении в течение почти двухчасов не отмечалось дополнительной деградации в значительной степени. Серийное разбавление среды после трехминутной инкубации в присутствии двухниточной РНК с неправильным связыванием снова продемонстрировало высокую степень разложения - примерно 50 при разбавлении 1:16, которая не возрастала при использовании более концент 1834663 1010 20 30 35 40 45 50 рировэнной сывороточной жидкости. Поскольку количество осаждаемого трехуксусной кислотой материала остается относительно постоянным в течение длительных периодов времени и.при различных степенях разбавления, то пролонгированная стабильность осаждаемого трехуксусной кислотой материала, вероятно, не связана с его преимущественной деградацией. Эти результаты также подтверждают.наличие в молекуле двуниточной РНК с неправильным связыванием ядра реэистентности по отношению к нуклеазе,Б. Молекулярный вес резистентного по отношению к нуклеазе ядра двуниточнойРН К с неправильным связыванием.Молекулярный вес определяли путем установления коэффициентов седиментации, Необработанные образцы двуниточной РНК анализировали в ультрацентрифуге"Бекман модел Е" при скорости 48000 оборотов в минуту и 20 С. Коэффициенты седиментации рассчитывали по пяти точкам, при интервале в 8 мин. Образцы двуниточной РНК разбавляли гак, чтобы оптическая плотность (002 бо) в буферном растворе А/0,15 молей МаС 1 0,01 моль фосфата натрия, 0,001 моль Мц С 2 р Н 7,2 l достигала 0,63, Образцы двуниточной РНК, обработанные нуклеазой Я, анализировали при скорости 52000 оборотов в минуту, 20 С в буферном растворе с 00260 = 0,65, Коэффициенты седиментации рассчитывали методом полувысот и второго момента.Коэффициенты седиментации, двуниточной РНК, определенные методом полувысот и второго момента, составляли соответственно 12,74 и 13,29. После гидро- лиза в присутствии нуклеазы 31 коэффициенты седиментэции двуниточной РНК, определявшиеся методом полувысот, снизились до 6,18, а полученные методом второго момента уменьшились до 7,21, Эти данные показывают, то при обработке нуклазой 51 двуниточная РНК с неправильным связыванием расщепляется на низкомолекулярные фрагменты.С. Биологическая активность резистентного по отношению к нуклеазе ядра двуниточной РНК.Биологическая активность расщепленной нуклеазой двунитотчной РН К испытывалась с помощью стандартного анализа на выявление замедления роста культуры опухолевой ткани. Двуниточную РН К инкубировали с нуклеазой 31 в течение 120 мин, а затем использовали для ингибирования роста культуры клеток человеческой фибросаркомы НТ 1080 С 14, Через 72 ч обработки двуниточной РН К с неправильным связыванием, расщепленной нуклеазой, в количестве 50 мкг/мл отмечался определенный рост необработанных контрольных клеток. Замедление роста клеток необработанной двуниточной РНК составляло примерно 50, Аналогичное замедление наблюдалось и в случае использования двуниточной РНК с неправильным связыванием, обработанной нуклеазой Я 1. причем вне Зависимости от степени обработки нуклеаэой 81. Тепловая денатурация в сочетании с обработкой нуклеазой 5 приводила к исчезновению антипролиферативного влияния двуниточной РН К с неправильным связыванием.Эти результаты указывают на то, что антипролиферативная активность двуниточной РНК с неправильным, связыванием сохраняется даже при длительной обработке нуклеазой. В связи с тем, что резистентное по отношению к нуклеазе ядро формируется в этой системе в первые 15-20 мин расщепления, то в последующие моменты времени торможение роста указывает на сохранение антипрофилеративной активности в резистентном по отношению к нуклеазе ядре двуниточной РНК. Это, в свою очередь, может являться причиной удивительно интенсивной выработки биологически активных медиаторов в различных отделах организма.С целью дальнейшего изучения биологической активности резистентного по отношению к нуклеэзе ядра, проводили расщепление двуниточной РНК с помощью нуклеазы 5 в течение 60 мин, Аликвоту этого материала затем подвергали осаждению метанолом с целью удаления низкомолекулярных продуктов расщепления, которые не могут быть осаждены с помощью такой процедуры. Для определения биологической активности культуру клеток глиомы человека линии А 1235 обрабатывали нерасщеппенной двуниточной РНК в количестве 200 ммкгмл, расщепленннойнуклеазой и осажденной этаноломдвуниточной РНК и расщепленным нуклеаэой 51 Амплигеном. Через 72 часа в культуре клеток линии А 1235 торможение в случае Амплигена составило 99,80, при использовании обработанного нуклеазой 51 Амплигена - 78,4,а для Амплигена,обработанного нуклеазой и осажденного этанолом,4;, Таким образом,. антипролиферативная активность двуниточной РНК сохранялась при различных видах обработки.Оценивали также способность этих препаратов индуцировать 2-5 А синтетазу (АТФ:(2, 5 - олиго (А) аденилил-трансфера- заЦЕС 2,7.7.19) в этих клетках линии А 1235, Осадок клеток после центрифугировэнияи ромы вали фосф атно-солев ым раствором,ресуспенди ровали в 5 мл растворяющего буферного раствора (20 миллимолей Трис, рН 7,5; 0,1 миллимолей этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,25 моля саха- розы, 50 миллимолей КС 2 миллимоля М 9 О 2 и 1 милливоль ОТТ) и выдерживали на льду в течение 5 мин. После двукратного промывания фосфатносолевым буферным раствором осадки клеток ресуспендировали в 0,1 мл буферного раствора В (20 миллимолей НЕРЕЯ; рН 7,5; 5 миллимолей М 9 О 2, 120 миллимолей ОТТ и 10 глицерина), содержащего ОЯ МопЫет - Р 40, и выдерживали на льду для растворения клеток. Цитоплазменные экстракты получали центрифугированием в течение 6 мин (8000 г) и хранили в виде 50-миллилитровых аликвот приС.2-5 А синтетазу анализировали в соответствии с описанным методом (Сухадольник и дрВосЬеавагу 22: 4153, 1983), Оттаявший экстракт (эквивалент 25 мг белка) смешивали с 30 мл упакованной поли (г 1), поли (гС) - эгэрозой и инкубировали при 25 С в течение 20 мин, Несвязанный белок удаляли двукратным промыванием в 0,4 мл буферного раствора В, Ферментативный синтез 2-5-олигоаденилатов (2-5 А) иниции- ровали добавлением 10 мл буферного зоаствора В, содержащего 2,5 миллимоля ( р) аденазин - 5 - трифосфата (0,12 Кюри) миллимоль), 2,5 миллимоля ОТТ, 3 единицы (мл креатиновой фосфокиназы и 10 молей креатинового фосфата), После 20-часовой инкубации при 30 С агарозу отделяли центрифугированием (3 мин 8000 г, 25 ОС), Смесь олигомеров 2-5 А во всплывшем отстое анализировали в колонке для диэтиламиноэтилцеллюлозной хроматографии в соответствии с описанием Доетша и др. (йасвге:291:355, 1981). Образование продукта устанавливали по величине изменения радиоактивности при замещении материала в колонке для диэтиламиноэтилцеллюлозной хроматографии буферным раствором, содержащим 0,35 моля КС, деленной на общую величину полученной радиоактивности.Синтез 2-5 А олигомеров путем инкубирования с освобождением из клеток экстрактом двуниточной РНК,. обработанным нуклеазой, после осаждения, показал, что переход аденазин - 5-трифосфата в 2-5 А олигомер зависит от времени. Получено несколько удивительных результатов. Во-первых, через 18 часов инкубации освобожденных от клеток экстрактов с необработанной двуниточной РНК с неправильным связыванием удельная активность 2-5 А синтетазы15 гомеров 2-5 А значительно увеличивается 20 30 35 40 45 ботанной нуклеазой после 18-часовой инку 5 10 50 55 составила 41,5. Во-вторых, после обработки нуклеазой 51 было отмечено заметное увеличение конверсии аденозин-трифосфата в 2-5 А синтетазу. Например, после 18 часов инкубации удельная активность достигала 284, что почти в 7 раз больше, чем в случаве необработанной двуниточной РНК с неправильным связыванием. В-третьих, при использовании двуниточной РНК, обработанной нуклеазой 31 после осаждения, максимальный выход синтетазы 2-5 А наблюдался после 12-часовой инкубации. Эти данные показывают, что ферментативный синтез тримеров, тетрамеров и более сложных олипосле обработки двуниточной РНК с неправильным соединением нуклеазой 51. Позитивная связь увеличения ферментной активности с уменьшением размеров двуниточной РНК является свидетельством того,что здесь может иметь место взаимодействие с аллостериновым модификатором, т.е,частично расщепленной двуниточной РНК с неправильным соединением, которое может приводить к его связыванию и улучшению активации синтетазы 2 - 5 А по сравнению со случаем необработанной двуниточной РНК с неправильным связыванием. Терапевтическое значение таких наблюдений является очевидным. В тех случаях,когда низкомолекулярные продукты разложения обработанной нуклеаэой 51, двунитотчной РНК с неправильным связыванием удаляли путем осаждения, максимально высокий синтез 2-5 А синтетазы наблюдали после 12 часов инкубэции, Максимально активное формирование синтетазы 2-5 А при использовании двуниточнай РНК, обработанной нуклеазой 1 после осаждения указывает на то, что резистентное по отношению к нуклеазе ядро может активизировать 2-5 А синтетазу точно так же, как это происходит при активации с помощью двуниточной РНК с неправильным связыванием, обрабации.Эти данные подтверждают наличие в двуниточной РНКс неправильным связыванием биологически активных фрагментов и служат объяснением физической основы терапевтической активности этих фрагментов в биологической жидкости. Эти данные также свидетельствуют о том, что биологическая активность этих фрагментов больше, чем у исходного соединения,П р и м е р 2, Другим примером практического применения изобретения является предотвращение заболеваний, распространяемых половым путем, например, таких, 1834663как цитомегэловирусные инфекции. Цитомегаловирус (ЦМВ). входящем в семействовирусов герпеса, только в США зараженоболее 1 млн. человек. У людей с ослабленной иммунной системой он может вызыватьжелудочно-кишечные расстройства или слепоту(обе серозные поверхности легко инфицируются вирусами, а вместе с тем не отличаются доступностью для многих системно применяемых противовирусных агентов).ЦМВ передается половым путем. Болеевысокая степень торможения (ингибировани) может быть достигнута путем генерирования с течением времени биоактивныхфрагментов (например. при введении двуниточной РНК с неправильным связыванием (Амплиген). Например, показано, что ингибирование ЦМВ после 24-часового воздействия фрагментов Амплигена достигает100 . Такое регулируемое выделение биоактивного материала, как происходит прииспользовании двуниточной РНК относительно нетоксичного типа, не может бытьлегко достигнуто в случае применения мазей местного действия и подобных средств,Генерирование биоэктивных фрагментов двуниточной РНК подтверждают исследования культуры тканей с ЦВМ. Частопоражения ЦМВ называют цетамегаловирусными инкулузиями, последниепредставляют собой обнаруживаемые в увеличенных клетках, пораженных вирусом, включения. Цетамегэловирусы человека составляют подгруппу вирусных агентов, тесно связанных или входящих в группувирусов герпеса. Несмотря на повсеместное распространение, число лиц, пораженных ЦМВ, переданным половым путем вСША, по оценкам, достигло в 1988 г. 1 илн. человек, Инфицирование обычно является бессимптомным, однако, у лиц с ослабленной иммунной системой могут возникать 20303540 желудочно-кишечные расстройства или слепота. Особенно чувствительны к ЦМВ новорожденные, этот вирус также может быть 45 причиной выкидышей. мертворождения и послеродовой смерти,В данном эксперименте использовали . следующие процедуры и материалы.50Извлекали фибропласты крайней плоти человека у новорожденных и выдерживали при низкой пассировке (20) в физиологическом растворе с солями Эрла,.куда добавляли 100 сывороточной жидкости эмбриона быка, 2 миллимоля 1:глютэмина, 1 миллимоль пирувата натрия, 20 миллимолей буфера НЕРЕЯ и антибиотики, После слияния клеток их выдерживали в вышеописанном растворе, из которого было удалено 57 ь сывороточной жидкости эмбриона быка.Ежедневно проводили анализы клеток на бактериальное или микоплазменное загрязнение.В исследованиях использовали штаммчело вече ского цетаме гало ви руса (ЦМ В АТ:С/ЧВ - 538, ветвь АО 169), Он состоял из второго посева в фибропласт крайней плоти человека, который собирали, когда действием ЦМВ было охвачено 75 реципиентных клеток. Освобожденный из клеток штамм вируса помещали в трубки для хранения и держали при -120 С. Тесты на бактериальную и микоплазменную стерильность дали отрицательные результаты, Титр инфекционной активности препаратов шиамма ЦМВ определяли на клетках фиброплста крайней плоти человека,он составлял 4 х 10 флюорисцентообразующих инклузий на миллилитр (см.далее),Использовали лиофлизид - клинический сорт Амплигенэ (двуниточная РНК с неправильным связыванием, поли 1, поли С 12, Ч фирма "Нем рисерч", Роквилл, шт.Мэриленд, США). В соответствии с инструкциями производителя Амплиген был реструктурирован, аликвотирован и хранилося при -120 С. Для каждого эксперимента проводили размораживание свежей аликвоты путем вращения в водяной бане при 50 С и разводили в вышеописанной тканевой питательной среде до нужных концентраций,Лекарственное средство инкубировэлис клетками фибропластов крайней плоти человека при различных условиях. К числу изменяемых параметров относились: (1) концентрация Амплигена; (2) последовательность воздействия Амплигеном на вирусные инклузии; (3) продолжительность воздействия Амплигена на эти клетки фибра пласта. Жизнеспособнось обработанных Амплигеном клеток фибропласта краййей плоти человека была такой же, как и в случае необработанных клеток, что определяли по инклузии голубого трипэна (т.е,990), Конфлуентные клетки фибропластовв крайней плоти человека культивировали на круглых покровных стеклах в ампулах с кожухом емкостью 3,7 мл (1 драхма), В ирусную инфекцию инициировали инкубированием этих ампул с 0,25 мл культуры ЦМВ соответствующего разбавления. Клетки крайней плоти человека подвергали воздействию ЦВМ в течение одного часа (700 кг, 37 С) для обеспечения поглощения вируса, Ампулы промывали 2-3 раза для устранения внеклеточного вируса. Затем в ампулы снова помещали 1 мл тканевой питательной среды и обычно инкубировали их 18-24 часа, при 37,С - 72 часа.5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Репликацию ЦМВ измеряли следующим образом, Вирусную репликацию останавливали, фиксируя фибропласты крайней плоти человека в 1000 -ном ацетоне. По- кровные стекла, на которых находились прилипшие клетки этих фибропластов, промывали и инкубировали с моноклональным антителом мыши (" Дюпон" ) антицетамегаловирусного типа, специфичным для непосредственного предшествующего белка массой 72 килодальтона, Связанное антитело детектировали путем добавления анти- агента цбЕ /аЬ/2 р 1 ОМА/ марки ЕГГС. Инфицированные вирусом клетки давали яблочно-зеленое ядерное флюоресцентное свечение при рассмотрении в эпифлюоресцентном микроскопе с 250-кратным увеличением, В микроскопе осуществлялся подсчет числа инфицированных клеток (т,е. тех, что содержали дающие ядерное флюорисцентное свечение инклузии). Препарат позитивного штамма разбавляли так, чтобы в отсуствие Амплигена он позволял получать 200-1200 зараженных ЦМВ клеток в расчете на одно предметное стекло через 24 часа инкубирования. Это достигалось при мул ьтиплетности инфекции 0,04.Определяли среднее число инклузий ЦМВ для репликатных покровных стекол в условиях всех экспериментов и сравнивали результаты с данными для позитивных контрольных клеток, не получавших Амплиген. Параллельно оценивали негативные контрольные образцы, которые не подвергали воздействию Амплигена или ЦМВ, Противо- вирусная активность Амплигена рассчитывалась в соответствии со следующей формулой;ингибирования инклуэий ЦМВ - среднее число инклузий ЦМВ/покровное стекло для обработанных Амплигеном клеток НГГ100 - среднее число инклуэий ЦМВ/покровное стекло для необработанных контрольных клеток НГГДанные о влиянии продолжительности предварительной обработки Амплигеном на инфицирование фибропластов крайней плоти человека с цетамегаловирусом. Репликатные монослои фибропластов крайней плоти человека подвергали: предварительной обработке 10 мкгlмл Амплигена или предварительной обработке 100 мг/мл Амплигена в течение указанных промежутков времени до поглощения ЦМВ, Степень инфицирования ЦМВ определяли через 24 часа после поглощения вируса описанным методомЕА. Среднее число инклуэий ЦМВ на одно покровное стекло для обработанных Амплигеном культур сравнивали с контрольыми результатами для необработанных лекарством культур. Полученные результаты свидетельствуют о том, что степень ингибирования цетамегаловирусной инфекции прямо пропорциональна продолжительности предварительной обработки Амплигеном, Максимальное ингибирование наблюдалось при предварительной обработке клеток НЕЕ Амплигеном в течение 24 часов.Данное исследование демонстрирует способность двуниточной РН К с неправильным связыванием оказывать противовирусное действие по отношению к ЦМВ, которое возрастает с течением времени, и чувствительность ЦМВ к двуниточной РХК с неправильным связыванием вне зависимости от использованной концентрации остается с течением времени на уровне, который не достижим при местном применении двуниточных РНК относительно нетоксичной группы. Процедуры также эффективны для снижения до предела потогенности фильтруемых агентов, выделяемых биологических жидкостях, например, фильтруемых агентов, найденных в биологических жидкостях, таких как спинномозговая (цереброспинальная) жидкость, особенно агентах, имеющих место при болезни Альцхеймера и других медленно прогрессирующих болезнях, или "медленных" вирусов, вызывающих медленно прогрессирующее умственное ухудшение,Формула изобретения Спбсоб лечения вирусных инфекций, путем введения в организм больного иммуномодулирующего препарата, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью повышения естественных противовирусных реакций и укрепления иммунной системы в локализованных отделах организма, в качестве иммуномодулятора используют препараты двуниточной РНК с неправильным связыванием, представляющих собой комплекс полиинозината и полицитидилата, содержащего от 1:5 до 1;30 урациловых или гуанидиновых оснований формулы г 1, гС 12-Сц, Ч)п или гЦС 29,6)п и вводят его в дозе 0,1-1000 мкг на 1 мл.1834663 18 Влияние системной обработки с помощью двуниточной РНК на уровень извлекаемого вируса в изолированной биологической жидкости (жидкостях)Пациент Экзогенная двуниточная РНК (полученноеколичество Г Время Нагрузка вируса сокультурой8 недель36 не ель Составитель О.КрюковаТехред М.Моргентал Корректор Т.Вашкович Редактор Заказ 2693 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035. Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 1. Пациент А(мужчина с инфекциейНТ 1 Ч - 11) Предварительная обработка 4 недели 30 недель Предварительная обработка 8 недель 40 недель Предварительная обработка