Способ количественного определения активности хлорамфениколоксидоредуктазы у микроорганизмов

Союз Советскии оциалистическик Республик(51)А; Кл.С 12 К 1/О 10,04,78 (2 присоединением заявки Ио осударственный комит СССР по делам изобретений и открытий(71) Заявитель ФРостовский-на-Дону государственный научноисследовательский противочумный институт(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯАКТИВНОСТИ ХЛОРАМФЕНИКОЛОКСЙДОРЕДУКТАЭЫУ,МИКРООРГАНИЗМОВ 2НаЯО 9 1,0; ОЬ - метионин, ПЬ, - треонйн й ПЬ -(-фенил-А-алании по 0,04;Ь - цистеин 0,1. Инкубационная смесьсодержит открытые клетки (5 мг сухойбиомассы в 1 мл), хлорамфеникол3,0 мкМ/мл, НАДИ Или НАДФНя 40 мкМ/мли вышеуказанную -среду до койечногообъема 2,0 мй. Контрольные растворысодержат все ком 1 тоненты за исключе-нием субстрата - хлорамфениколалибоисточника фермента. Инкубацию проводят в атмосфере азота (аназробныеусловия) в теченйе 2 ч. Бактериальныеклетки осаждйбт внесениеМ впробы 5 0,2 мп 50-ного раствора трихлоруксусной кислоты. ОбраэовавЫййсяосадок отделяйт цейтрифугйрованием(4000 5 Мин), и в надбсадочнойжидкости определяют содержание первичного ароматического амийа. Иэ надосадочной жидкости отбирают 1,0 мл,приливают по 2,0 мл 0,25 н. НСВ ипо каплям 1,0 мл 0,1 НаЮОо до появления избытка ННО Вследствие неустойчивости солей диазония, легкодиссоциирующих на катйон диазония ианнов галогена, диазотирование проводят в охлажденной бане со льдом,= 0 - 5 С. В процессе диаэотирования реакционная смесь должна иметь Изобретение относится к области медицины, а именно микробиологии.Известен способ количественного определения активности хлорамфенйколоксидоредуктазы у микроорганизмов путем выращивания их в питательной среде с последующим суспендиро" ванием, инкубированием, осаждением белка из микроорганизмов и опрЕделением активности фермента по количеству восстановленного в реакции диазотирования р-аминохлорамфеникола,Однако известный способ является длительным.Целью изобретения является ускорение способа.Эта цель достигается тем, что4 суспендирование проводят в маннйт-ми. неральной среде на трио-НС 8 -буфере при рн 7 в . 8 и инкубируют в анаэроб" 2 ных условиях в присутствии источника электронов НАДИ или НАДФНЭП р и м е р 1. Клетки чумного микроба выращивают в течение 48 ч на агаре Хоттингера (рН 7,1) при 28 фС. Собранную бактериальную массу пере носят в маннит-минеральную среду, приготовленную на 0,02 М трис-НСВ-буфере (рН 7,8) следующего состава,в г/л; маннит 5,0; МЧЯО 4 0,25;(НН 4.)Я 04 1,0;3.3.;,7064444сильнокислую реакцию, Пробы тщатель- материала. Инкубационная смесь вно перемешивают на холоду в течение объеме 2 мл содержит бесклеточный10 мин, после чего раствор должен . экстракт (6 мг белка), хлорамфенидавать отчетливую положительную реак- кол 3 мкМ/мл, НАДНили НАДФНцию на иодкрахмальной бумаге, 40 мкМ/мл и маннитминеральную синтеИзбыток ННОз, в пробах устраияют 5 тическУю среду, приготовйенную надобавлением 0,4 мл 10,-ной мочевины 0,02 М трис - НС 8-буфере (рН 7,8) .и спустя 10-15 мин завершение реак- Контролями служат пробы без источ "цйитакже регистрируют с помощьюника фермента (экстракта) и без субиодкрахмальной бумаги. Далее к про- . страта (хлорамфеникола).Остальные.бам добавляют,0,5 мл 0,3-ного р-ра 1 О этапы общиес ПРиведенными в примес(-.наФтиламина, который готовят на ре 1,смеси 20 мп уйсусной кислоты и80 мп н О. Азосочетание проводят в за единицу активности фермента приизбЫтке д. -нафтиламйна в течейие йймают такое-"его количество, котороечаса при охлаждении до 0-10 С. катализирует образование 1 нмоля рИсследуеМый раствор должен иметь аминоХлорамфеникола в 1 ч при данных15:рН 4,0-4,5 (индикатор бромфеноловый условиях опыта, Удельную активностьсиний), который доводят с помощьюсу- хлорамфениколоксиредуктазы выражаюткого ЯаНСОили 1 н, ИаОН;" Прироств единицах на 1 мг белка. Использооптической плотности в опытной про- вание изобретения позволяет ускоритьбе измеряют на спектрофотометре 20 расшифровку"механизмов хромосомной,(Сф) при 520 нм против пробы,со- и плазмидной устойчивости к хлорамдержащей толькб реактивы, Колнчест- фениколу у возбудителей чумы и холеры.во"ароматического амина хлорамфенив ко. расчитывают по калибровочномуграфйку "используя вкачестве стан формула изобретениядарта р-аминобензойную кислоту илилюбой другой коммерческий ариламин. Способ количественного определенияОбразованию 0,02,мк пбля ариламинаактивности хлорамфениколоксидоредуктасбответствуетизменение оптической зы у микроорганйзмов путем выращиванияйбтности на 0,150.30 их в питательной среде с последующимП р и м е р2, Клетки чумного суспендированием, инкубированием,микроба выращивайт на агаре Хоттин- осаждением белка из микроорганизмов игера (рН 7,1) в течение 48 ч при определением активности фермента по28 С; Бактерийльн 9 ю массу отмывают количеству восстановленного в реакот питательной средй 0,85-нйм раст- З 5 ции диазотирования р-аминохлорамфенивором хлористдго натрия, растирают кола, о т л и ч а ю щ и й с я тем,скварцевым песком, экстрагируют что, с целью ускорения способа,0,02 Й трис НИ - буфером (рН 7,8) суспендирование проводят в.маннит-:. в течение 12 ч при 4 ОС. Экстракты, минеральной среде на трис-НСЯ -буфе йолученнйе после часового центрифу ре при рН 7-8 и инкубируют в анагирования при 15000 ф на холоду, эробных условиях в присутствии истоЧ"используйтв качестве ферментного ника электронов НАДНили НАДФН 2Составитель Е. ДубовицкаяРедактор Г, Прусова Техред И.Асталош Корректор О. КовинскаяЗаказ 8163/22 . Тираж 526ПодписноеЦНИИПИ Государственйого комйтета СССРпо делам изобретейий и открытий113035 Москва, ЖРазыская наб.д д, 45филиал ППП фПатент, г. Ужгород, ул. Проектная,4