Способ получения рестриктаз

.ЯО 14 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ ВИДЕТЕЛЬСТВУ К АВТОРСНО етод выявриктазы1986, 1 СУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Научно-исследовательский конструкторскб-технологический институтбиологически активных веществ(56) Таняшин В,И. Рестриктирующиеэндонуклеазы (Молекулярная биология)Итоги науки и техники. М., 1979,т. 12, ч. 1, с.58-91.Н 1 пея,1.Ь , СЬацпсеу Т.К.,Ааагча 11 К.Ь. Ргерагадоп ап) ргорегг 1 ея ог гЬе Нра 1 апс 1 Нра 11 еп)1 опцс 1 еаяея - 1 п: МегЬойя 1 п епгущо 1 о 8 у,Ю,У. 1980, ч. 65, рагс 1; р.153-163.Бондарь Т.С., Зернов Ю.П.,Пустошилова Н,М. Получение ферментовизучение их свойств и механизмов ихдействия, В кн,: Всесоюзная итоговая конференция "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование". Латвийский гос. ун-т им.П.Стучки, Рига, 1985, с.41-44.Майстренко В,Ф. и др. Мления высокоочищенной рестХва 1. - Биотехнология, М.с.26-30,(5 Н 4 С 12 И 9/16, 1/20//(С 12 Я С 12 К 1:01)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗ(57) Изобретение относится к биохимии и микробиопогии, а именно к полу"чению рестриктаз. С целью упрощенияпроцесса выделения целевого продуктаи повышения его активности исходныеклетки микроорганизмов - продуцентоврестриктаз в процессе разрушенияультразвуком подвергают термообработке при температуре от 50 до 60 С втечение от 3 до 10 мин, центрифугируют, а надосадок используют для дальнейшей хроматографической очистки це"левого продукта при комнатной температуре.Изобретение относится к микробиологии, в частности к выделению и очистке рестриктаэ, синтезируемых микроорганизмами. 5Цельй,изобретения является упрощение процесса выделения целевого продукта,Способ заключается в следующем.Клетки бактерий вносят в охлажденОный буфер и подвергают дезинтеграцииультразвуком, доводя температуру (онаповышается в процессе дезинтегра"ции) до 50-60 С, выдерживая при этойтемпературе 3-10 мин, затем экстракт 15освобождают центрифугированием отдебриса клеток, а надосадок используют для хроматографии, Полученные фракции исследуют на наличие, фермента,объединяют и диализуют против 50 - 20ного раствора глицерина. Все стадиивыделения фермента .проводят при комнатной температуре.Данный способ термообработки грубых клеточных экстрактов был апробирован для рестриктаз: Хва 1, Хва .1,Нра 1,11, Нпй 1, НЬа 1,. Нае 11,111,Вя 1 11, Ара 1, Бац 96 1. Выделениерестриктаз после термоинактивациипримесных ферментов на стадии получе ния грубого экстракта .клеток микроорганизмов позволяет исключить многостадийное фракционирование, ускоритьпроцесс выделения, упростить его иповысить выход целевого продукта, 35Вследствие того, что примесные проте -олитические ферменты инактивируютсяна первой стадии и рестриктаэы ими.не гидролизуются на последующих стадиях, процесс выделения в дальнейшем 40можно проводить при комнатной температуре,Оптимальными являются температуры50-60 С, при которых происходит инактивация неспецифических ферментов в 45течение 3-10 мин, что позволяет проводить выделение указанных ферментовдаже из биомасс микроорганизмов, содержащих большое количество неспецифических нуклеаз.50П р и м е р 1. Выделение рестриктазы НЬа 1.1,.0 г влажных клеток бактерии Нае.шорМ 1 пэ Ьаешо 1 удсцэ суспендируют в4.мл 0,4 М МаС 1 в буфере А (10 мМК-фосфатный буфер, рН 75; 10 мМ2-меркаптоэтанолй,1 мМ Ма- ЭДТА)с добавлением тритона Хдо 0,1 .,оСмесь охлаждают до 6 С и подвергают дезинтеграции ультразвуком на дезинтеграторе ."ЮЕ" (Англия) с помощью конического стержня с диаметром нижнего конца 3 мм, Разрушение проводят при амплитуде "15" в течение 3 мин 15 с под контролем термометра до досотижения 50 С, а затем охлаждают до 4-6 С,Затем освобождаются от дебрисаоклеток центрифугированием при 18000 об/мин в течение 30 мин, Полученный экстракт разбавляют в 2 раза 0,01 М калийфосфатным буфером,рН 7,5, содержащим 10.мИ 2-меркаптоэтанола, .1 мМ трилона Б, и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р 11 ("ИаИппап"). Элюцию сорбираванных белков проводят линейным градиентом ИаС 1 в буфере А Отбирают Фракции объемом 0,8-0,9 мл и анализируют на содержание рестриктазы. Для этого 5 мкл каждой фракции вносят в 40 мл реакционной смеси, содержащей 1 мкг фага ламбда, 7,5 мМтрис-НС 1,рН 7,5, 10 мМ 2-меркаптоэтанола,6 мМ М 880 0,1 М ИаС 1. Гидролизо проводят в течение 15 мин при 37 С. Затем вносят 10 мкл смеси Б (додецилсульфат натрия 0,2 , трилон Б 34 ., сахароза 50 ., бромфеноловый синий 0,025 ). Пробы наносят на 1,4 -ный агарозный гель и проводят электрофорез. Фракции, содержащие фермент, объединяют. Активность фермента послехроматографии на фосфоцеллюлозе Р в среднем составила 27 тыс.ед.акт./гбиомассы, удельная активность -2400 ед.акт./мг.фермент не содержал существенныхпримесей неспецифических нуклеаз ифосфатаз, как следовало из данных подлительному (174) гидролизу ДНК фагаТ 7 и тесту рестрикция - лигирование -рестрикция,П р и м е р 2. Выделение рестриктазы Хва 1.1,0 г влажных клеток бактерии Хапсошопаэ ЬадгЫ суспендируют в 4 мл буфера (10 мМ трис-НС 1 рН 7,9; 10 мИ 2-меркаптоэтанола) с добавлением до0,11 тритона ХОО, охлажденного до6 С, и подвергают дезинтеграции ульт"развуком при частоте 20 кГц и ампли-отуде 15 мкм до 55 С в течение 3 мин.Затем освобождаются от дебриса клетокпутем центрифугирования при 18000 об/14061нВес 1 цпап"). Полученный экстракт разбавляют в 2 раза 0,01 М калийфасфатным буфером,рН 7,5, содержащим 10 мМ2-меркаптоэтанола, 1 мМ трилона Б,107. ,глицерина (буфер А), и наносят наколонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию сорбированных белков проводят линейнымградиентом КС 1 фермент элюируетсяКС 1 при концентрации 0,3-0,5 М Отбирают фракции объемом 0,8-0,9 мл ианализируют на содержание рестриктазы Хва 1. Для этого 5 мкл каждой фракции вносят в 40 мкл реакционной сме.си, содержащий 1 мкг ДНК йага Т 7: 15б мМ трис-НС 1,рН 7, 9;6 мИ 2-меркаптоэтанола; 6 мМ МдС 1, Гидролиз проводятв течение 15 мин при 37 С. Затем вкаждую пробу вносят 10 мкл смеси Б.Пробы наносят на 0,87.-ный агарозныи 20гель и проводят электрофорез в 90 мИтрис-боратном буфере рН 8,3, содержащем 2,5 мМ трилона Б, Электрофорезведут в течение 2 ч при силе тока50 мА. Затем гели окрашивают этидиумбромидом (5 мкг/мл) и просматриваютв ультрафиолетовом свете. Фракции,содержащие рестриктазу, объединяют идиализуют в 502-ном растворе глицерина, содержащем 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ трилона Б. Активность полученного фермента Хва 1 из 1,0 г влажных клеток составляет 5000 ед. активности, что в 2 раза выше,чем при получении известным способом. Хранитсяофермент при температуре -10 С,П р и м е р 3. Выделение рестрик,тазы Хша 1, (ХапгЬошопаз ша 1 га сеагиш).Вьщеление рестриктазы проводят, 40как указано в примере 1, за исключением того, что клетки разрушают безчтермообработки (на ледяной бане) притемпературе не выше 10 С 5 раз поо45 с с интервалом 45 с с последующимих прогреванием 10 мин при 50 С наводяной банеАктивность полученногопосле фосфоцеллюлозы РферментаХша 1 составила 200 ед.акт./г биомассы. 50П р и м е р 4, Вьщеление рестрик-.тазы Хша 1.Вьщеление проводят аналогично примеру 3, за исключением того, что клетки после разрушения не подвергалитермообработке. Активность ферментасоставила 50 ед.акт,/г биомассы.П р и м е р 5. Выделение рестриктазы Нае 11 (НаешорМ 1 цз аеВурйдцз). 59Выделение проводят, как указано впримере 1, за исключением того, что1,0 г клеток разрушают 4 мин до досчтижения температуры экстракта 51 О С.Активность фермента Нае 11 составила2600 ед.акт./г биомассы. Фермент сохранил 503 активности через 9 мес хранения при температуре -10 С.П р и м е р 6. Вьщеление рестриктазы НЬа 1.Вьщеление проводили аналогичнопримеру 1, за исключением того, чтоклетки в процессе разрушения и посленего не подвергали термообработке.Фермент не выделен из-за большогоколичества неспецифических нуклваз.П р и м е р 7. Выделение рестрик"тазы .Ндпг 1.1,0 г влажных клеток бактерии НаешорЫ 1 цз пГ 1 цепеае Всуспенди-руют в 4 мл буфера (1 О мИ трис-НС 1,рН 7,5; 10 мМ 2-меркаптоэтанола), охлажденного до 6 С, и подвергают де-,зинтеграции ультразвуком при частоте20 кГц и амплитуде 15 мкм до достижеония температуры 60 С и выдерживаютпри ней в течение 5 мин.Выделение проводят, как в примере 1, Активность полученного фермента Ндпй 1 из 1,0 г влажных клетоксоставляет 10000 ед.актнвности, чтопочти в 70 раз выше получения известным способом, Фермент хранится притемпературе -10 С.П р и м е р 8. Вьщеление рестриктазы Нае 111,Вьщеление проводят из 1 г клетокбактерии НаеторЬ 1 цз аеВург.1 цз В,как в примере 1, Термообработку проводят при 50 С 10 мин. Фермент элюируется раствором ХаС 1 при концентрации 0,8-1;0 М. Активность выделенногофермента Нае 111 из 1,0 г влажныхклеток составляет 10000 ед.активности. Хранят фермент при температуре-10 С.П р и м е р 9. Вьщеление рестриктазы Нра 1, 11,Выделение проводят из 1,0 г клетокбактерии Н. рагадпЕ 1 иепаае, как впримере 1. Термообработку проводятпри 40 С 10 мин. фермент выделен небыл из-за большого количества неспецифических нуклеаэ.П р и м е р 10. Вьщеление рестриктазы НхпГ 1.Выделение проводят,как в примере 1оТермообработку проводят при 65.С1406159 10 мин. Количество фермента, выделенное в 1 г биомассы, снизилось,о чемсвидетельстЪует наличие недорестрикции субстрата в стандартных условияхопределения активности. Формула изобретения Составитель Н. Ходарев Редактор Н.Швыдкая Техред А. Кравчук КоРРектоР И,ЭрдейиЗаказ 3157/23 Тираж 520 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Иосква, Ж, Раушская наб д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Способ получения рестриктаэ, вклю Очающий получение грубого экстрактапутем разрушения, исходных клеток микроорганизмов ультразвуком и освобождения от дебриса клеток центрифугированием, хроматографическую очисткуцелевого фермента и диализ в 507-номрастворе глицерина, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса выделения целевого продукта и повышения его активности,клетки при разрушении подвергают термообработке при температуре от 50 до60 С в течение от 3 до 10 мин.