Способ получения -глобулина, ассоциированного с болезнью крона

(50 САНИЕ ИЗОБРЕТ ВТОРСНОМУ СВ ЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(57) Изобретение относится к биохимии. Целью является разработка способа получения о -глобулина, ассоциированного с болезнью Крона. Тканьжелудочно-кишечного тракта, пораженную болезнью Крона, гомогенизируют,смешивают с экстрагирующим буфером(трис-глициновый 0,05 М, рН 8,6 сдобавлением твин - 80 и тритон Х в концентрации 1 мл на 1 л буфера) всоотношении 3:1, Экстракт замораживают и размораживают, центрифугируютпри 15000 об/мин в течение 30 мин. Кнадосадку добавляют сульфат аммониядо 757. насыщения инкубируют в течение 12 ч. Взвесь центрифугируют при15000 об/мин в течение 30 мин притемпературе -4 С, Осадок растворяют в 0,05 М натрийфосфатном буфере рН7,4 и лиофилизируют. Лиофилиэат растворяют и диализируют против натрийацетатного буфера и=0,025 с рН 4,45в течение 24 ч, хроматографируют нацеллюлозе ДЕАЕ - 52, уравновешиваютнатрийацетатным буфером р =0,025 срН 4,45 Элюируют линейным градиентом хлорида натрия 0,25-0,5 М, отбирая фракции в диапазоне 0,38-0,46 Мхлорида натрия, диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют.Лиофилизат растворяют в натрийацетатном буфере рН 5,6, изохроматофокусируют на целлюлозе ДЕАЕ - 52 и элюируют 2 Е-ным раствором амфолинов,рН 6-4 и 4-2,5, отбирают фракцию вдиапазоне рН 4,8-5,6 и лиофилизируют.Лиофилизат растворяют в натрийфосфатном буфере 0,05 М рН 7,4 и гель -хроматографируют на сефадексе С с отбором фракции с мол.м,85+10 кД.Препарат подвергают конечной доочистке на иммуносорбенте на основе цианбромированной сефарозы 4 В и специфических антител, которые элюируют0,02 М глицин - НС 1 буфером рН 2,2,диализируют и лиофилизируют.1 13Изобретение относится к области биохимии, преимущественно к препаративной биохимии, и может быть применено для разработки технологии получения Ы-глобулина толстой кишки,ас - социированного с болезнью Крона (КАГ), 1Целью изобретения является разработка способа получения о -глойбулина, ассоциированного с болезньюКрона,КАГ является новым, ранее нигдене описанным и не полученным белкоми способ его получения является новым и строго специфическим.Способ осуществляется следующимобразом.Ткань желудочно-кишечного тракта,пораженную болезнью Крона, тщательноотмывают от сгустков крови в забуференном физиологическом растворе, азатем гомогенизируют в гомогенизаторе "Биомикс" (ВНР) при 10000 об/мин.Гомогенат смешивают с экстрагирующим буфером (трис-глициновый 0,05 М,рН 8,6 с добавлением твини тритон Хв концентрации 1 мл на 1 лбуфера) в соотношении 3:1. Экстрактпоследовательно трехкратно замораживают и размораживают, а затем центрифугируют при 15000 об/мин в течение30 мин, К надосадку прибавляют сульфат аммония до 757. насыщения и инкубируют на магнитной мешалке в течение 12 ч. Взвесь центрифугируют при15000 об/мин в течение 30 мин приотемпературе -4 С, Осадок растворяютв 0,05 М натрийфосфатном буфере рН7,4 и лиофилизируют. Лиофилизат растворяют в дистиллированной воде и диализуют против натрийацетатного буфера р =0,025 с рН 4,45 в течение24 ч,Отдиализированный препарат подвергают ионообменной хроматографиина РЕАЕцеллюлозе, уравновешеннойнатрийацетатным буфером р =0,025 срН 4,45. Элюцию КАГ проводят линейным градиентом хлорида натрия от0,25 до 0,5 М, отбирая фракции в диапазоне 0,38-0,46 М хлорида натрияПолученный препарат диализуют против дистиллированной воды и лиофилиэируютЛиофилизат растворяют внатрийацетатном буфере рН 5,6 и подвергают изохроматофокусированию нацеллюлозе ЭЕАЕс элюцией 27.-нымраствором амфолинов рН 6-4 и рН 4-2,5("1,КВ",Швеция) . При элюции отбираютфракцию в диапазоне рН 4,8-5,6.Фрак 18915 2 дят 0,02 М глицин-НС 1 буфером рН 2,2.Конечный препарат диализуют и лиофи лизируют.Анализ полученного препарата показывает высокую степень его очистки (в 2000 раз) с сохранением нативных свойств, Потери препарата при реали зации предлагаемого способа не превышают 303. Принадлежность белка к с -глобулинам показана электрофоре 2тически в полиакриламидном геле.Интервал элюции КАГ с ионообменного анионообменника определен экспериментально и находится в интервале 0,38 - 0,46 М хлорида натрия. Выбор определенной дискретной точки .из этого интервала (например 0,38 30 или 0,42, или 0,46) невозможен, так 35 45 50 55 цию диализуют против дистиллированной воды в течение 24 ч и лиофилизируют. Лиофилизат растворяют в натрийфосфатном буфере 0,05 М с рН 7,4и подвергают гель-хроматографии на сефадексе С - 150 с отбором фракции с мол,м. 85 10 кД, Полученный препарат подвергают конечной доочистке на иммуносорбенте, приготовленном наоснове цианбромированной сефарозы4 В и специфических антител к КАГ. Элю.цию антител с иммуносорбента провокак это приведет к значительным потерям КАГ, который диффузно распределен именно в этой зоне.Элюция раствором хлорида натрия с молярностью меньше 0,38 М не приводит к отрыву КАГ с анионообменника.Элюирование раствором хлорида натрияболее 0,46 М сопровождается снятиемс носителя дополнительных примесейбелка, затрудняющих последующую очистку,Отбор белковой фракции в интервале рН 4,8-5,6 диктуется тем, что изоэлектрическая точка КАГ лежит именно в этом интервале, и в связи с этим ограничение отбора определенной дискретной точки (например: 4,8 или 5,2 или 5,6) сопровождается значительной потерей КАГ. Отбор белковой фракции с изоточками ниже 4,8 и выше 5,6 приводит к тому, что КАГ с носителя не снимается.Амфалины с рН 6-4 и рН 4-2,5 позволяют создать градиент рН 5,8-3,0, что строго специфично для КАГ,П р и м е р 1, 50 г ткани толстой кишки, пораженной болезнью Крона, тщательно отмывали от сгустков крови3 13189 в забуференнам Физиологическом растворе, а затем гомагенизиравали в гамогенизаторе Биамикс" (ВНР) при 10000 об/мин. Гомогенат смешивали с экстрагирующим буфером - трис-глициновый 0,05 М рН 8,6 с добавлением твин в 80 ) ("МегЕ", ФРГ) и тритон Х ("Регго 1" ГДР) в концентрации 1 мл на 1 л буфера - в соотношении 3:1. Экстракт последовательно трехкратно 1 О замораживали и размораживали, после чего центрифугировали при 15000 об/мин в течение 30 мин. К надосадку добавляли сульфат аммония до 757. насыщения и инкубировали на магнитной ме шалке в течение 12 ч. Взвесь центрифугировали при 15000 об/мин в течение 30 мин, Осадок растворяли в 0,05 М натрийфосфатном буфере рН 7,4 и лиоФилизировали. Лиофилизат растворяли 20 в дистиллированной воде и диализовали против натрийацетатного буфера (ионная сила 0,025; рН 4,45) в тече.ние 24 ч. Отдиализованный препарат подвергали ионаобменной хроматогра фии на ВЕАЕ - 52 целлюлозе ("Иагчап", Англия), уравновешанной натрийацетатньп) буфером (ионная сила 0,025; рН 4,45), Элюцию КАГ проводили градиентом хлорида натрия от 0,25 до 30 0,5 М с отбором белковой фракции в диапазоне 0,38-0,46 М хлорида натрия. Полученный препарат диализовали против дистиллированной воды и лиофилизировали, Лиофилизат растворяли в натрийацетатном буфере рН 5,6 и подвергали изохроматофокусированию .на целлюлозе ЭЕАЕ("Иажап", Англия) с элюцией 27.-ным раствором амфолинов с рН 6-4 и рН 4-2,5 ("1.КВ", 40 Швеция). При элюции отбирали фракцию в диапазоне рН 4,8-5,6. Фракцию диализовали против дистиллированной воды в течение 24 ч и лиофилизировали, Лиофилизат растворяли в натрийфос фатном буфере 0,06 М, рН 7,4 и подвергали гель-хроматографии на сефадексе С("Р 1)агшаг 1 а Е 1 пе Сеппса 1 в", Швеция) с отбором фракции с мол.м. 85+10 кД. Полученный препарат 50 подвергали конечной доочистке на иммуносорбенте, приготовленном на основе цианбромированной сефарозе 4 В ("Рпагшаг 1 а. Рпе Сепп.са 1 з", Швеция) и специфических антител к КАГ, Элю цию антител с иммуносорбента проводили 0,02 М глицин-НС 1 буфером рН 2,2. Конечный препарат диализовали и лио 15 4Филизировали; Реализация предлагаемого способа позволяла получать 672 мкг препарата КАГ с чистотой 98,52.П р и м е р 2. 50 г ткани толстой кишки, пораженной болезнью Крона, тщательно отмывали от сгустков крови в забуференном физиологическом растворе, а затем гомогенизировали в гомогенизаторе "Биомикс" (ВНР) при 10000 об/мин. Гомогенат смешивали с экстрагирующим буфером - трис-глициновый 0,05 М; рН 8,6 с добавлением твин("Мег 1"., ФРГ) и тритон Х("Реггог", ГДР) в концентрации 1 мл на 1 мл буфера - в соотношении 3:1, Экстракт последовательно трехкратно замораживали и размараживали, после чего центрифугировали при 15000 об/мин в течение 30 мин. К надосадку добавляли сульфат аммония до 75/ насыщения и инкубировали на магнитной мешалке в течение 12 ч, Взвесь центриФугиравали при 15000 об/мин в течение 30 мин,Осадок растворяли в 0,05 М натрийфосфатнам буфере рН 7,4 и лио-. Филизиравани. Лиафилизат растворяли в дистиллированной воде и диализовали против натрийацетатного буфера (ионная сила 0,025; рН 4,45) в течение 24 ч. Отдиализованный препарат подвергали ионаабменнай хроматографии на 0 ЕАЕцелл,олазе ("1)агыап", Англия), уравновешенной натрпацетатным буферам (иаццая сила 0,025; рН 4,45). Элюцию 1 ЫГ проводили 0,46 М раствором хларида натрия, Полученный препарат дпализавали против дистиллированной воды и лиафилизиравали. Лиофилизат растворяли в натрийацетатнам буфсре рН 5,6 и подвергали изахроматафакусираванию ца целлюлозе 1)ЕАЕ("1 агыап", Англия) с элюцией 27,"ным растворам амфалицав с рН 6-4 и рН 4.5 ("1.КВ . Швопия), Пои элоции атбиралп Фрасц)по в ди,:пазане рН 4,8-5,6, Фракц)по д:з-:авали против дистиллированной ва.и:течение 24 ч и лиафилизнравали, Лиафинизат раст - воряли в натрийфасфатнам буфере 0,05 М рН 7,4 и падвер;ели ; ель-хроматографии и сефадсксе С("1%агшас 1 а Р 1 пе С 1 еппса 1 э", Швеция) с отбором Фракции с мал,м. 85+10 кД. Получецный препарат подвергали конечной доачцстке на иммуносорбенте приготовленном ца а сцс)вс п 1 анб 1)амп 1)Ованной сефаразы 4 Б 1"11)агп)ас)а Гз. -Составитель А.АгуреевТехред М.Ходанич Корректор А.Обручар Редактор Л.Гратилло Заказ 2504/38 Тираж 776 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 Производственно-полиграфическое предприятие,г.ужгород,ул.Проектная,4 5 13 пе Сйеппса 1 з", Швеция) и специфических антител к КАГ. Элюцию антител с иммуносорбента проводили 0,02 М гли- цин-НС 1 буфером рН 2,2, Конечный препарат диалиэовали и лиофилизировали, Реализация предлагаемого способа позволила получить 672 мкг препарата КАГ с чистотой 787.формула изобретения Способ получения. сп -глобулина, ассоциированного с болезнью Крона, включающий гомогенизацию ткани желудочно-кишечного тракта, пораженной болезнью Крона, экстракцию буферным раствором при рН 8,6 с добавлением детергентов, высаливание экс-. тракта, далее полученный осадок растворяют, диализуют, хроматографируют с помощью анионообменного носителя 189156при этом проводят элюцию в линейномградиенте хлористого натрия от 0,25до 0,5 М, отбирают фракции препаратав диапазоне 0,38-0,46 М хлористогонатрия и лиофилиэируют их, далее растворенный лиофилизат подвергают изохроматофокусированию и отбирают фракции в диапазоне рН 4,8-5,6 и лиофилизируют их, растворенный лиофилизат Ю подвергают гель-хроматографии наСс отбором фракции, имеющеймол.м. 85+10 кД, далее полученнуюфракцию используют для приготовленияантительного иммуносорбента, при 15 этом в качестве сорбента берут цианбромированную сефароэу, далее препарат с мол.м. 85+10 кД подвергаюточистке на полученном иммуносорбентепутем элюции его 0,02 М буферным ра створом при рН 2,2, элюат диализуюти лиофильно высушивают.