Способ выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы

(54)БИЛЬНФАТАгировнатрлиэномтем,целев тор 0,1 при ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИ ПО ДЕЛАМ ИЗОВРЕТЕНИЙ ИСАНИЕВТОРСЙОМУ СВИД(71) Астраханский государственныймедицинский институт им.А.В.Луначарского(56) 1. 1,еЬшап Р.С., 1,еЬшап Р. Ке 8 апдвоепгуш: 1 во 1 дегип 8 Йег аЖа 1 двЬепРговрЬагаве дев шепвЬТдсЬег Р 1 асепгащит ЕпгчдсИцпр едпег ешрЬНпй 1 дсЬеп ИегЬойе Ыг Йде Рщпогйда 8 повг 1 с)с.-Юегп. ЙеигвсЬ. Сег. А 1 шш.Мей.80 Коптюг. ЮдевЬайеп, 1974,р. 1658-1661.2. Авторское свидетельство СССР9 1082811, кл. С 12 Б 9/14, 1984,8011 138410 А 57) СПОСОБ ВЫДОИ ПЛАЦЕНТАРНОЙЫ, предусматриание ткани рася, прогреваниеэлектро 4 орезеле, о т л и ччто, с целью увого продукта иперед диалиэоме прогревание0,183-ного сер2-65 С в теченЬ ЕЛЕНИЯ ТЕРМОСТАНЕЛОЧНОЙ ФОС- ающий экстра- вором хлористого экстракта, диа- полиакриламида ю щ и й с я еличения выхода, упрощения спопроводят пов-присутствии окислого кадмия е 1-5 мин.11384Изобретение относится к медицине, а именно в биохимии, и может быть использовано для выделения термостабильной плацентарной щелочной Фосфатазы. 5Известен способ выделения щелочной фосфатазы, включающий обработку гомогената ткани бутанолом, фракционирование ацетоном и сульфатом аммония, гельфильтрацию и ионообменную хро- . 10 матографию 1.Недостатками данного способа являются его сложность, длительность и низкий выход целевого продукта,Наиболее близким к изобретению 15 по технической сущности и достигаемому эффекту является способ выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы, предусматривающий экстрагирование ткани 3 М раствором хлористого натрия, прогревание экстракта в течение 10 мин при 65 С, фракционирование хлористым цетилпиридинием и сульфатом аммония, диализ, и очистку целевого продукта электро форезом в полиакриламидном геле 2;1.Недостатками известного способа являются невысокий выход целевого продукта (72 ), а также его сложность заключающаяся в наличии двух стадий фракционирования.Цель изобретения - увеличение выходацелевого продукта и упрощение способа.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы, предусматривающему экстрагирование ткани раствором хлористого натрия, прогревание экстракта, диализ и электрофорез в полиакри 40 ламидном геле, перед диализом проводят повторное прогревание в присутствии 0,14-0,18 -ного сернокислого кадмия при 62-65 С в течение 1-5 мин.45Эффективность очистки при варьировании в предлагаемых интервалахконцентраций сернокислого кадмия,температуры и времени практически неизменяется. За пределами этих интер-.50валов или не достигается очисткифермента, например, прогреваниепри 45 С, или происходит его инактивация (табл. 1),Прогревание без добавления сернокислого каДмия .приводит к 4,3-крат-,ному увеличению удельной активностицелевого продукта. 10 3Добавление сернокислого кадмия в концентрации 0,14-0,18 не приводит к значительному увеличению удельной активности: в этом случае выпадает в осадок около 30% балластных белков и удельная активность фермента возрастает в 13,5 разОднако одновременное проведение двух обработок сернокислым кадмием и нагреванием, приводит к 15-кратной очистке с очень высоким выходом - более 90 .П р и м е р 1. 1 этап. Приготовление плацентарного тканевого экстракта: гомогенизация при 8000 об. /мин в течение 5 мин отмытой от крови плаценты в 3 М растворе хлористого калия(вес-объемное соотношение 1:3-4); перемешивание на магнитной мешалке при 4 С в течение 12 ч; центрифугирование при 6000 об,/мин в течение 30 мин. Дальнейшее исследование проводят с надосадочной жид-. костью после диализа против дистиллированной воды (2 смены по 60 .мин) и 0,1 моль раствора хлористого натрия (2 смены по 60 мин).2 этап. Полученныйплацентарный экстракт прогревают при 65 ОС в течение 10 мин и центрифугируют при 8000 об,/мин в течение 20-30 мин.13 этап. К надосадочной жидкости добавляют сульфат кадмия из расчета 0,14 -ной концентрации в итоговом растворе и проводится повторное прогревание при 65 С в течение 3 мин. Осадок отделяют путем центрифугирования при 8000 об./мин в течение 20- 30 мин.4 этап. Надосадочную жидкость диализуют в течение 10-12 ч против ацетатного буфера (рН 4,5).5 этап. Доочищение препарата проводится методом препаративного диск-электрофореза в 7 -ной полиак-. риламидном геле с последующим извлечением из геля термостабильной щелочной фосфатазы электрофоретически. Гель, содержащий фермент, вырезают под визуальным контролем после окрашивания методом азосочетания (субстрат - нафтол - АЯ - ВБ - фосфат, краситель - прочный синий соль В), Количество очищенной термостабильной щелочной Фосфатазы определяют методом Лоури. Результаты очистки термостабильной щелочной фосфатазы плаценты даны в табл. 2.Таблица 1 1 аУсловия выделения Общая Вес Удельная Выход, Хактив- белка, нг активность,ость, ед ед,/мг Количествоисследуемогоматериала, мл Прогревание при456 С 1200 15870 6850 2,3 100,0 Прогревание при65 С 93,8 1150 14900 1520 9,8 Добавление сульфатакадмия при прогревании 45 С : 0,14 0,18 Х 65 С : 0,14 Ж2,4 1150 15700 6500 1150 15650 6400 1070 14790 470 1050 14740 430 98,9 98,8 2,44 31 ь 5 93,1 0,18 34,3 93,0 80 С: 0,14 0 985 0,18 90 980 О 65 С 0,263 0,6 350 220 1,4 1050 3 11384П,р и м е р 2. Выделение проводят аналогично примеру 1, но используют 0,183-ный раствор сульфата кадмия. Выход на этой стадии составляет 937 против 93,1% по примеру .Зависимость активности щелочной фосфатаэы от условий выделения (температуры и концентрации сульфата кадмия) дана в табл. 1.Прогревание при 62 ф в течение 1 О 1 или 5 мин приводят к тем ае результатам (табл. 1).При введении вместо сульфата кадмия 0,283-ного сульфата натрия 10 4при последующем прогревании не наблюдается увеличение выпадания в осадок балластных белков по сравнению с контрольным опытом, в котором не добавляют никаких солей.Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет значительно увеличить выход целевого продукта с 723 до 92,97, а такыре значительно упростить выделение фермента за счет замены стадий фракционирования хлористым цетилпиридинием и сульфатом аммония простейшей стадией термообработки.1138410 Таблица 2 Условия очистки Этап мг 100,0 1200 15880 6900 2,3 1520 918 93,8 14900 2 Первичное прогревание 1150 3 Добавление сульфата кадмия 93,2 14800 1100 1120 13,2 4 Вторичное прогре- вание 93,1 1070 470 31,5 350 42,2 14790 14770 92,9 1070 5 Диализ при рН 4,5 6 Итог (после электрофореза) 41,2 358,4 14770 10,0 92,9 Составитель В. Муронец Редактор И Дербак .Техред Т,дубинчакКорректор Л. ПилипенкоЗаказ 760 Тираж 525 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 1 , Экстракт после обработки хлористым калием 1 Количествоисследуемогоматериала Общаяактивностьед. Количест во белка дельнаяактивностьед./мг Выходцелевого про-дукта,Х-