Способ получения коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином

СОЮЭ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН 80132 511 А 1 5 06 51)4 С ЫЙ КОМИТЕТ ССС РЕТЕНИЙ И ОТНРЫ УДАРСТ ДЕЛАМ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ПОСОБ ПОЛУ 11 ОВ, СОЦЕРЖА 11 ФИБРОНЕКТЯ 10 зобретение ности подуя ов, содержал фнбронктнн биохимии,.НИЯ КОЛЛАГЕНОВЫХИХ УЧАСТОК СВЯЗ(54 ТИД тидов,новыхсвязывакасается и ения колла в час пепти асто испольом, котор с ощени е уют ЬвЫ(71) Институт биологической и медицинской химии АМН СССР(56) М.С 1 с 1, Р.,ВогпзГегп "1 зо 1 аС 1 оп апд сЬагасгег 1 хас 1 оп оГ где суапо 8 еп Ьгопийе рерггдез Ггои Ю 1 апд Я 2 сЬа 1 пв ог Ьпшап а 1 гп со 11 а 8 еп". РАосЬешдасгу 970, 9, 24, 4699-4706. процесса и повышение выхода" целевыхпродуктов. 11 олучейие ведут бромцианфрагментированием коллагена с последующим хроматографированием в определенных условиях. Хроматографирование ведут на сефарозе с иммоболизированным желатин-связывающим доменомфибронектином, уравновешенном 0,040,06 М трис-НС 1-буферным растворомс рН 7,4-7,6, содержащим 0,1-0,15 М,хлористого натрия при скорости тока50-250 мл/ч и 37-40 С. Затем полонку промывают 1-1,5 М мочевиной вуравновешивающем буферном растворе,а элюирование коллагеновых пептидов,содержащих участок связывания с фибронектнном, проводят 4-8 М растворами мочевины в указанном выше буферном растворе, Способ позволяет сократить число стадий с 5 до 2, времяпроцесса в три раза и повысить выходс 5 до 257, 1 13275Изобретение относится к усовершенствованному способу получения коллагеновых пептидов, содержащих участоксвязывания с фибронектином, биологически активных соединений, которыенаходят применение в биохимии.Цель изобретения - упрощение процесса коллагеновых пептидов, содержа"щих участок связывания с фибронекти"ном, повьппеиие выхода целевого про"дукта.П р и м е р 1. Получение И 1-СВ 7бромцианоного пептида коллагена.А, Бромциан - фрагментация целоймолекулы коллагена. Раствор 180 мгколлагеиа изкожи крыс в 18 мл70 -ной муравьиной кислоты насыщаютБ , добавляют 200 мг бромистого циана и полученную смесь инкубируют 5 чпри 25 С. Реакционную смесь обессоо20ливают на колонке с биогелем Р(Ч 100 мл), уравновешенным 0,1 М уксусной кислотой, Скорость тока45 мл/ч. Фракцию, ныходящую с исключающим объемом колонки,.лиофилиэуют и получают 165 мг смеси бромцианоных пептидов коллагена,Б. Выделение с 1-СВ 7 пептида изсмеси бромцианоных пептидов коллагена. Полученную смесь бромцианоныхЗОпептидов коллагена (65 мг) растворяют в 20 мл 0,05 М трис-НС 1 рН 7,4,с 0,15 М хлористым натрием при на"гревании до 40 С и раствор перемешивают при 20 С в течение 1 ч с 5 млсефарозы 4 В, содержапей иммобилизонаниый желатинснязынающий домен фибронектина (мол.в, 45000) (содержаниедомена в адсорбенте 1"2 мг/мл упакованного объейа геля). Затем адсорбентупаковывают в колонку, промываютуравновешивающим буферным раствором(50 мл), затем тем же раствором, содержащим 1 М мочевину (50 мл), Скорость. тока 200 мл/ч. Ы 1-СВ 7 пептидэлюируют уравновешивающим буфернымраствором, содержащим 4 М моченину.Фракцию, содержащую1-СВ 7 пептид,обессолинают на колонке с биогелемР, уравновешенным 0,1 М уксусной 50кислотой, и лиофилизуют, Выход Ы -СВ 7пептида 7,5 мг;(25 ). Продукт былэлектрофоретически гомогенным приэлектрофорезе в полиакриламидном ге"ле в присутствии додецилсульфата натрия (мол. в. около 25000).При скорости потока 150 мл/ч, температуре 37 С получают е(1"СВ 7 пептидс вьгходом 27 .,1 211 р и м е р 2. Получение насцентных коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибропектином.Раствор смеси насцентных Р-пепти" дов, полученных в бесклеточной сис" теме биосинтеза белка и меченных Н- пролином (суммарная радиоактивность 1,5 10 распадов/мин), в 3 мл 0,05 М трис-НС 1, рН 7,6, с 0,15 М хлористым натрием инкубируют в течение 1 ч при 20 С с 3 мл иммобилиэоваиного на се" фарозе 4 В желатинсвяэывающего доме- . на фибронектина. Адсорбент упаковыва" ют н колонку, промывают 40 мл уравновешивающего буферного раствора до от" сутствия радиоактивности в элюатах. Скорость тока 200 мл/ч. Затем колон" ку.промывают 1 М мочевиной в уравновешивающем буферном растворе (15 мл) и насцентные пептиды коллагена, содержащие участок связывания с фибро" нектином, элюнруют 8 М мочевиной в уравновешивающем буферном растворе. Суммарная радиоактивность полученной фракции (б мл) - 5 10 распадов/мин, После диализа этой. фракции против 0,05 М трис-НС 1 буферного раствора, рН 7,6, содержащего 1 М хлористый натрий, проводят анализ целевых насцентных пептидов коллагеназной реакцией.Аналогичные результаты получены при проведении хроматографии смеси насцентных пептидов при 40 С и скорости тока 250 мл/ч.К 0,1 мл исходных и полученных после хроматографии насцентных Р - . пептидов, меченных 1 Н-пролином (110 распадон/мин), добавляют 10 мклУраствора коллагеназы (1-5 мкг белка), свободной от примеси других проте" инаэ. Контрольные пробы не содержат коллагеназу, Пробы инкубируют н течение 90 мин при 37 С, после чего пептиды осаждают равным объемом ,0%-ной трихлоруксусной кислоты с 0,53 таннина. Осадки собирают на фильтры (М 111 грог), высушивают и определяют радиоактивность в сцинтилляционном счетчике, Расщепление Р- пептидов рассчитывают по формулеОо 00Р %=00еК фгде О " радиоактивность опытныхпроб;К врадиоактивность контрольныхпроб,27511 4 1 О 15 40 45 50 55 3 13Согласно полученным данным исходная смесь насцентпых 1 -пептидов расщеплялась коллагенаэой на 57, в товремя как насцентные пептиды, элюированиые с аффинного адсорбента 8 М.мочевиной в уранновешивающем буферном растворе, расщеплялись на 907.Таким образом, элюированный с колонки препарат на 90/ состоит из насцентных коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином.П р и м е р 3. А, Получение желатинсвяэывающего домена фибронектина,300 мг лиофилиэованного фибронектина иэ плазмы крови человека суспендируют в 60 мл 0,025 М трис-НС 1 буферного раствора, содержащего 0,5 ммольЭДТА и 50 ммоль НаС 1 (рН 7,0), добавляютмг Ы-химбтрипсина и смесь инкубируют при перемешивании 1 ч при37 С. Затем к смеси добавляют 3 мгингибитора трипсина из соевых бобови 1 ммоль Фенилметилсульфонилфторида,через 10 мин центрифугируют при10000 об/мин н течение 10 мин, супернатант наносят на колонку (Ч 60 мп) сжелатин (сефарозой) уравновешенную0,025 М трис-НС 1 буферным растворомс 0,5 ммоль ЭДТА и 50 ммоль НаС 1(рН 7,0), колонку промывают тем жебуферным раствором до отсутствия поглощения при 280 нм н элюатах и желатинсвязывающий домен фибронектинаэлюиронали, добавляя в буферный раствор 4 М мочевину. СоответствующиеФракции ( 60 мл) диализуют против2 л 0,1 М уксусной кислоты, Выходжелатинснязывающего домена послелиофилизации - 25 мг, мол. массаоколо 45000. При электрофорезе в12,5 ь-полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфоната натрияпродукт был гомогенен,Б. Получение адсорбента "доменфибронектина (мол. масса 45000)сефароза 4 В".Лиофипизованиый желатинсвязывающий домен фибронектина, полученныйв и. А (25 мг),растворяют в 15 мл0,1 М бикарбонатного буферного раствора, рН 8,4, содержащего 0,15 МВаС 1 и перемешивают с 15 мл ВгСК -активиронанной сефарозы 4 В (активирована по стандартной методике с использованием 2 г ВгСИ на.10 мл упакованного объема сефарозы) в течеоиие 16 ч при 4 С. Сорбент промынают50 мл того же буферного раствора,50 мл воды и перемешивают 2 ч прн20 ЯС с 15 млМ раствора этаноламина (рН 9 с помощью 6 н, НС 1), Сдрбентотделяют и трижды промывают по 50 мл0,1 М натрийацетатного буферного раствора сМ МаС 1, рН 4,5 и О, Мнатрийборатного буферного раствора с1 М ИаС 1, рН 9. После промывания водой сорбент хранят в виде суспензиив воде в присутствии 0,023 азиданатрия. Количество присоединенногодомена определяют дифференциальнымметодом по разности поглощения при280 им исходного раствора лиганда ипромывных вод после присоединения,Сорбент содержал 1,5 мг домена на1 мл упакованного объема геля. Такие параметры хроматографического процесса, как геометрия колонки или условия последующего обессоливания соответствующих фракций не сказываются на конечных результатах, Обессолинание фракций проводят на колонках с биогелем Р, уравновешенных 0,1 М уксусной кислотой, при скорости тока 30-50 мл/ч и объемном соотношении вводимого образца к общему объему колонки :5. Те же результаты 30получены и при использовании для обессолинания сефадекса С, Что касается скорости тока при афинной .хроматографии,то хроматографию денатуриронанного коллагена и коллагеноных 35 пептидов обычно проводят при. температуре до 40 С и при большой скорости тока из-за склонности этих биополимерон к ренатурации и гелеобразованию. Поэтому скорость тока н описываемомпроцессе целесообразно поддерживатьв интервале 150-250 мл/ч, Выбор уравновешивающего буферного раствора(0,05 М трис-НС 1, рН 7,4-7,6 с 0,10,15 БаС 1) обусловлен необходимостьюсоздания на колонке оптимальных условий для взаимодействия иммобилизонанного домена с пептидами, содержащимиучасток связывания с Фибронектином.При использовании 0,04-0,06 М буфероврезультаты выделения оказываются практически идентичными, как и в случаеиспользования 0,1-0,15 М концентраций МаС 1, Применение концентрацийВаС 1 менее 0,1 М приводит к менее чистым пептидам, содержащим участок связывания с фибронектином, а более0,15 М - к элюиронанию части этихпептидов при промывании колонки уравновешивающим буферным раствором иТираж 348 ПодписноеВНИИПИ осударственного комитета. СССРло делам изобретений и открытий13035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Заказ 3392 Производственно-полиграФическое предприятие, г. ужгород, ул, р.ктлая,4 5 13275М мочевиной в том же буфере, что уменьшает выход целевого продукта,Стадия промывания колонки 1 М мочевиной предназначена для удаления с колонки неспицифически адсорбиро"5 ванных пептидов, не содержащиХ участка связывания с фибронектином, Для этой цели использованы растворы мочевины в концентрации,1-1,5 М, При . концентрации моченины меньше 1 М неспецифические пептиды удаляются не полностью, загрязняя целенбй продукт, при концентрации,большей, чем 1,5 М происходит частичное элюирование коллагеиовых пептидоЬ, содержащих участок связывания с фибронектином, что снижает выход целевых продуктов. То же относится и к условиям элюции,поскольку согласно биохимический дан" ным 4"8 М мочевина эФфективно разобщает биоспецифическое взаимодействие фибронектина и коллагена (желатина) При использовании концентрации мочевины меньшей, чем н описываемом про" цессе, возможно вымывание пептидов неспецифически связанных с сорбентом за счет электростатических или гидроефобных взаимодействий.П р и м е р 4. Раствор бромцианоных пептидов Ы 1-цепи койлагена (100 мг 1 в 12 мл 0,06 М трис-НС 1, рН 7,5 с 0,1 М хлористым натрием перемешивают при 20 С в течение 1 ч с 1 О мл сефарозы С -4 В, содержащей иммобилизован. Ный желатин-связывающий домен фибронектина (1 мг/мл упакованного объе" ма), сорбент упаковывают в колонку, промывают уравновешивающим буферным раствором (50 мл), затем тем же раствором, содержащим 1,5 М мочевину (30 мл), Скорость тока 150 мл/ч.Целе 40 вой Й 1-СВ 7. пептид элюируют уравнове" 11 6шивающим буферным раствором, содержа" щим 6 М моченину. Соответстнуккцую фракцию обессоливают на колонке с биогелем Руравновешенным 0,1 М уксус" ной кислотой, лиофилизируют. Выход Ы"СВ 7 пептида 4,4 мг (24,5 Х) Продукт идентичен Ы 1-СВ 7 пептиду, полученному в примере 1.Описываемый способ получения нас- . центных пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, позволяет сократить число стадий с 5 до 2 время проведения процесса сокра- щается в три раза, ныход увеличивается в пять раз (с 57 до 253). Формула изобретения Способ. получения коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, включающий броманфрагментирование коллагенна и последующую хроматографию смеси бромциановых пептидов с. использованием в качестве элюента буферных растворов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и повыше ния выхода, хроматографию проводят на сефарозе с иммобилизованным желатинснязывающим доменом фибронектина, уравиовешенном 0,04-0,06 М трис-НС 1 буферным раствором с рН 7,4-7,6, содержащим 0,10-0.15 М хлористого натрия при скорости тока 150-250 мл/ч, температуре 37-40 С с последующим промыванием колонки 1-1,5 М мочевиной в уравновешивающем буферном растворе, элюиронание коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, проводят 4-8 М растворами мочевины в том же буферном растворе.