Способ получения полинуклеотидфосфорилазы из клеток

Изобретение относится к биохимии ибиотехнологии и может быть использованодля получения в препаративных количествах ферментного препарата полинуклеотидфосфорилазы (ПНФазы) для использованияв синтезе полинуклеотидов или для иныхцелей.Цель изобретения - увеличение выходацелевого продукта и упрощение способа.На фиг, 1, 2 даны графики зависимостии концентрации ПНФазы в верхней фазесоответственно от концентрации соли (хлористого натрия) и от температуры обработки,Способ осуществляют следующим образом, Культивируют продуцент - ЕзспегсЫасоИ В до максимального накопления фермента. Биомассу отделяют в буферном растворе, содержащем 2 мМ дитиотреитол (ДТТ),куда добавляют лизоцим в количестве 2 мг/гклеток. Смесь выдерживают 45 мин при 4 С,,Затем в суспенэию добавляют растворы дексграна, полизтиленгликоля и натрия хлористого до конечных концентраций (мас)0,5-0,9; 2,5 - 3,0; 6,0 - 9,0 соответственно исмесь подвергают термообработке при 56 -58 С в течение 2-20 мин. После охлаждениясмеси ее центрифугируют при 3000 об/минв течение 20 мин и верхнюю фазу подвергают очистке хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и ДЭАЭ - сефадексе, Выходцелевого продукта ПНфазы составляет 40 -45 ед,акт,/г клеток. препарат фермента обладает высокой функциональной чистотой.В случае большого масштаба выделения фермента термообработку проводят впроточном аппарате, Аппарат состоит издвух теплообменников и перистальтического насоса. В первом теплообменникесмесь нагревают до 56-58 С и выдерживают в течение 2-20 мин, а во втором охлаждают до 5-10 С,Изобретение иллюстрируется следующими примерами,П р и м е р 1. Операции очистки проводят при 0-5 С, 100 г замороженных клетокЕ.соИ суспендируют в 300 мл буфера (0.02моль/л трис-НО рН 8,1: 2 ммоль/л ДТТ), Всуспензию добавляют 200 мг лизоцима, растворенного в 2 мл буфера, Смесь выдерживают в течение 30-40 мин при 0-5 С,постоянно перемешивая, затем добавляют24 мл 20-ного раствора декстрана (мол,м,500000), 48 мл 407 ь-ного раствора полиэтиленгликоля (мол,м, 6000). 178 мл (4 моль/л)хлористого натрия (до конечных концентраций 0,8; 2,9 и 6 соответственно) и 63 млисходного буфера.Смесь перемешивают и с помощью перистальтического насоса пропускают через50 55 П р и м е р 3. ПНФазу выделяют из 100 г клеток по примеру 1, но добавляют декстран, полиэтиленгликоль и хлористый натрий до концентраций 0,3; 2 и 2,5 соответственно, При этом образуется мутная ПЭ Г-фаэа (примеси нерастворимых компонентов), а выход целевого продукта составляет 5 ед.акт,/г клеток.П р и м е р 4. ПНФазу выделяют из 100 г клеток по примеру 1, но используют декстран. полиэтиленгликоль и натрий хлористый в концентрациях 1; 3,2; 120, соответственно. Термообрэботку проводят при 58 С е течение стеклянный теплообменник с теплоносителем при 57 С, а затем через теплообменник,охлаждаемый ледяной водой. Скорость прокачки выбирается такой, чтобы время на 5 хождения смеси в первом теплообменникебыло около 10 мин, Охлажденную смесьцентрифугируют при скорости 3000 об/минв течение 20 мин. Верхнюю фазу сливают идиализируют против исходного буфера до10 снижения концентрации хлористого натриядо 0.15 моль/л. Затем диализат наносят наколонку с ДЭАЭ-целлюлозой (Нк=100 мл) ипосле промывки элюируют 1 л буферногораствора с линейным градиентом хлористо 15 го натрия до 0,15 моль/л, Затем диализатнаносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой(Нк=100 мл) и после промывки элюируют 1 лбуферного раствора с линейным градиентом хлористого натрия 0,15 - 0,5 моль/л, Ак 20 тивные фракции обьединяют и добавляютсульфат аммония до 850 ь-ного насыщения,Осадок отделяют центрифугированием растворяют в 30 мл буфера (0,02 моль/л трисНО рН 7,5,2 ммоль/л ДТТ). Раствор наносят25 на колонку с ДЭАЭ-сефадексом (НМ=100 мл)и после промывки буфером, содержащим0,25 моль/л натрия хлористого, злюируютфермент буфером с линейным градиентомконцентрации натрия хлористого 0,25 - 0,530 моль/л,Активные фракции объединяют и концентрируют диализом против насыщенногораствора сульфата аммония в буфере (0,02моль/л трис-НО.рН 8,1, 2 ммоль/л ДТТ),35 После диализа осадок отделяют центрифугированием и, растворив в небольшом количестве буфера. диалиэируют против негов течение 15-20 ч.Выход ПНФазы 45 ед.акт./г биомассы.40 П р и м е р 2. ПНФаэу выделяют иэ 100г клеток по примеру 1, но используют декстран, полиэтиленгликоль и хлористый натрий в концентрациях 0,5; 2,5 и 9соответственно, Термообработку проводят45 при 56 С, Выход ПНФазы 40 ед.акт,/г клеток,1453893 40 45 мония и последующий диализ, 50 отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и упрощения способа, извлечение фермента осуществляют путем термообработки суспензии клеток в буферном растворе, со держащем декстран, полиэтиленгликоль ихлористый натрий соответственно в концентрациях, мас.: 0,5 - 0,9; 2,5 - 3,0: 6,0- 9,0, при 56 - 58 С в течение 2 - 20 мин. 10 мин. Выход целевого продукта - ПН Фазы 20 ед,акт,/г клеток.П р и м е р 5. ПНФазу выделяют из 100 г клеток по примеру 1, но термообработку проводят в течение 1 мин, Выход целевого продукта 16 ед.акт./г клеток.П р и м е р 6. ПН фазу выделяют из 100 г клеток по примеру 1, но термообработку проводят в течение 25 мин, Выход целевого продукта 37 ед.акт,/г клеток,П р и м е р 7. ПНФазу выделяют иэ 100 г клеток по примеру 1, но варьируют концентрацию хлористого натрия от 0 до 9. Результаты представлены на фиг. 1. Максимальный выход фермента отмечен при концентрации 1 чаС 1 6-9 ф,П р и м е р 8. ПН Фазу выделяют иэ 100 г клеток по примеру 1, при этом температуру термообработки варьируют от 0 до 70 С. Результаты, представленные на фиг, 2, свидетельствуют о том, что максимальный выход фермента происходит при температуре 56-58 С.П р и м е р 9. ПНФаэу выделяли из 100 г клеток по примеру 1, но термообработку проводят в течение 2 мин. Выход целевого продукта - ПНФазы 44 ед.акт./г клеток.П р и м е р 10. ПНФазу выделяют из 100 г клеток по примеру 1, но термообработку проводят в течение 20 мин. Выход целевого продукта - ПНФазы 45 ед,акт./г клеток,П р и м е р 11, 10 г замороженных клеток суспендируют в 30 мл известного буфера, содержащего 0,1 моль/л имидазол-НС 1, рН 7,0, 0,25 моль/л МаС 1, и разрушают ультразвуком - 4 раза по 30 с на дезинтеграторе УЗДН, Затем суспенэию разбавляют буфером до 80 мл и центрифугируют на центрифуге 12-2 при 20000 об/мин в течение 20 мин. Осадок вновь суспендируют в 20 мл буфера и "озвучивают" в том же режиме, Суспензию объединяют с супернатантом (Ч=100 мл) и добавляют растворы декстрана, полиэтиленгликоля и натрия хлористого до конечных концентраций 0,7; 2,7 и 7 Я соответственно. Смесь перемешивают и прогреФормула изобретенияСПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДФОСФОРИЛАЗЫ ИЗ КЛЕТОК ЕзсЬегсЫа со В, включающий культивирование продуцента до максимального накопления фермента, отделение биомассы, суспендирование ее в буферном растворе, разрушение клеток. извлечение фермента иэ клеточной суспенэии, очистку хроматографией. концентрирование сульфатом ам 5 10 15 20 25 30 35 вают в проточном теплообменнике с теплоносителем при 57 С в течение 10 мин и охлаждают ее, Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, верхнюю ПЭ Г-фазу после диализа наносят на колонку с ДЭАЭ-сефадексом (1,6 х 20 см) и после промывки колонки проводят элюцию градиентом 0,25 - 0,4 моль/л МаС 1. Объем градиента 200 мл. Активные фракции объединяют и осаждают белок 80-",ь-ным сульфатом аммония. Осадок растворяют в 0,01 моль/л трисНС 1-буфера рН 8,4. содержащего 0,001 моль/л ЭДТА, 0,001 моль/л ф-меркаптоэтанола и 0,1 моль/л йаС 1. Полученный раствор подвергают очистке на колонке с сефадексом 6 200 (2,6 х 80 см), собирают активные фракции, объединяют и концентрируют осаждением сульфатом аммония; Осадок растворяют в трис-НС 1-буфере рН 8,4 и после диалиэа против этого же буфера получают готовый продукт - препарат ПНФазы. В результате из 10 г клеток (биомассы) получают 380 ед,акт. ПНФазы или 38 ед,акт,/г с характеристиками, аналогичными указанным в примере 1.Изобретение позволяет упростить аппаратурное оформление процесса за счет исключения стадий длительного высокоскоростного центрифугирования и ультразвукового разрушения клеток, существенно повысить выход целевого продукта с 16,5 ед,акт, до 45 ед,акт. иэ 1 г клеток продуцента, снизить трудоемкость процесса за счет упрощения и увеличить выход целевого продукта.(56) 61 ап, Игпи М, Озе о 1 Е.со, Ро 1 упцс 1 еобе рЬозрйогу 1 азе аког тле Яупйезз о 1 0119 обеохуг 1 Ьопос 1 еоббез о 1 Оейпеб Яесиепсе - 1 п МеЬобз и Епгугпооцу, 1980, ч. 65, р, 687 - 693.Багдонас А.С Сабаляускене В.Л 1 Оодка Б.А, Выделение полинуклеотидфосфорилаэы из Е.со 1 и некоторые ее свойства, Биохимия, 1981, т, 46, вып, 5, с. 802-808,1453893 ии, фгФиг.1 Воробтал Составитель ехред М.Мо Редактор Г. Бельске Корректор ач каз 3467 пи водственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,Ъ . Ю 4Тираж П НПО "поиск" Роспатента13035, Москва; Ж; Рауаская наб.