Способ получения антибиотика

ОЛ ИСАНИЕ п),ОЗ 5 З 1ИЗОБРЕТЕН Ия Союз Советских Социалистичесаа Республик(33) США Государственник комитет Совета Министраа СССР оо делам иэооретений н открмтий(43) Опубликовано 15.02,76. Бюллетень(45) Дата опубликования описания 18.07.77 УДК15.779.9:576.85 72) Авторы изобретени Иностранцыдислав Джемс Ханка и Давид Гленн Марти) Заявитель 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТ Изобретение относится к микробсобам получения антибиотиков. логическим ения антибиотика путовусеа в аэробных Предлагают способ получ культивирования Зтге11-СН-СЯНиспользуют Зтгертощусеа Вчсеца.фильтрат культуральной жидкионообменной смолой, и далееэлюируют,сти адсорби, ую елевой продух Ощетку целевого п роматографии на колонк аминовой смолы стироль ой хроматографии и кр В качестве ионообмпутем полиодукта производяе иэ слабооснов ого типа, распре ли тель. стаяли эации. иной смолы бе молу сульфоновой кислоты с льного условиях в жидкои питательнои среде, соде источники углерода, азота и минеральные последующим выделением целевого про фильтрата культуральной жидкости и очисткС целью получения антибиотика, им Антибиотик назван АТ - 1 25.Установили, что абсолютная конфигурацияантибиотика АТ - 125 ь - -аБ, 58 - а - амико хлор - 2- изоксазоай 5- уксусная кислотаОна а является амфотерным соединением и может встречаться в разных йонных формах в зависимости от значения рН окружающей среды. При низких значениях рН она существует в виде соли с кислотами, при более высоких значениях рН - в виде цвит- О териона и при еще более высоких значениях рН - ввиде соли с металлом., АТ - 125 ингибирует рост грамположительных играмотрицательных бактерий, таких, как Вас 11 цв ацЬт 1 я, ЕасЬегсЬа со 1. Он также действует на 5 различные грибы и дрожжи, например Яасспагопусес разтогапца, Репс 11 цт оха 1 сцп;, СапдЫа аЬсапа, ЯассЬаготусеэ сегечеае. В связи с этим новый антибиотик можно применять отдсльно или в сочетании с другими средствами, предупреждаю- О щими развитие или боле знетворное действиемикробов, для предупреждения роста бактерий, дрожжей и грибов или сокращения их числа в различных окружающих средах. Его можно приме.нять, например, для обработки мест разведения 25 шелкопряда в целях предупреждения или умень503531 1, Способ получения антибиотика путем культивирования Ятгертоаусез в азробных условиях вжидкой питательной среде, содержащей источникиуглерода, азота, минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из фильтратакультуральной жидкости и очисткой, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью получения антибиотика,имеющего структуруС 1сисеХдГС 1 СИ СО,111 3используют Ятгертогпусез зч 1 сеиз.2, Способ поп.1, отличающийся тем,чтофильтрат культуральной жидкости абсорбируютионообменной смолой и далее злюируют целевойпродукт,3. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтоочистку целевого продукта производят путемхроматографии на колонке из слабоосновной полиаминовой смолы стирольного типа, распределительной хроматографии и кристаллизации.4. Способно п.2, отличающийся тем,чтов качестве ионообменной смолы применяют смолусульфоновой кислоты стирольного типа.1 Оетг А, 1954 Апп, Р Ч Асад. Яс60:152 - 154.2, Тгезпег, Н.О апд Е.д. ВасЬз 1962. Арр 1.М сгоЬ 01 11:335 - 338.3, Ргдпап, Т.сз.С.Ю Неззе 1 спе апд В,б.Вепед 1 ос, 1958 Арр, МсгоЬо 6:52 - 79.4. Оетг А., апд оЬп Матпеччз 1970, Арр 1.МсгоЬо 21:527 - 533.5, Рг 1 дЬапз, Т.б. апд О. Сзосс 11 еЬ, 1948. д.Вастего 1 56:107:114.6, Я 1 з г 1 пд Е, В., апд О. ОоЮ еЬ, 1966.Ъз. . Яуг. Вассего 16:313 - 340. Составитель М. Дражжинников Тер ец М. Левицкая Корректор С. Шекмар Нцактор Л.овожилова Заказ 955/504 Тираж 555 Поцдисное ЦИИПИ Госуцарсгвенного комитета Совета Минисгров СССР но делам изобретений и открытий13035, Москва, Ж, Раунская набц, 4/57. Вегдеуз Мапса 1 о 1 Оетеггп 1 пат 1 че Васте.- по 1 оду, 7-е издание (Вгеед ВоЬегт, Я Е.О. Мсг-;гау, апд Матпап Я Ягп 1 тг 1957 Вегдеу"а п 1 апца 1 о 1детеггппатче Ьастег 1 о 1 оду, ЕтЬ Ед 1 топ, тпе ЧП 1.- 1 апзз апд УУ 11 Ыпз Со., Ва 1 т 1 гпоге.8, Вегдеуз Мапса под именем Гаузе Г,Ф.Преображенская Т,ПКудрина Е,С., Блинов Н.О.,Рябова И.Д, и Ивешник М.А. Вопросы классификации антагонистических актиномицет. Госуд. Издательство Медицинской литературы, Москва,1957 г, Хюттером (Нцссег, В 1967. Яуятепзат 1 с дегзтгертогпусетег сптег Ьезопдегег Вегйс 1 сзспс 1 допддег чоп ппеп деЬ 11 десеп АпсЬос 1 са, Я, Кагдег,Вазе), Красильниковым Н,АРуководство по оп.ределению бактерий и актиномицет, Акад, НаукСССР, Москва, 1957, Ваксманом (1 еа 1 сзгпап, Я.А.1961, Т 1 зе асспопзусесея, чо 1 2, С 1 азз 1 Х 1 сасоп,1 дептбсатоп, апд дезсгрт 1 опа о 1 депега апд зресеа. ТЬе й 11 апз апс Яарпа СО., Васгпоге), иШирлингом и Готлибом (ЯЬгпд, Е,В., апд О.сзотт еЬ. 1968 ТптЯцз. Вастего 1 18:69:189;18:279 - 392; 19:391 - 512).9. Сгоп. М, ОР УЪтеЬеад, 1.В. Ноорег, В.,Непегпапп апдеи, 1956 АпсЬотсв апд сге -гпотЬегару 60:63:67.10. 1 птегп,Яувсегп Вастег 1 о 1 16:459 - 490.11., Оетг, А., Аппа 1 а о 1 спе Мече ЧоганАсадегпу оХ Ясепсез, 60:152 - 154, 1954,12. асоЬзоп, Е., УУ.С. сзгапч 111 е апс С,Е.Роза. 1948, Сопса 1 пег Согрогасоп о 1 Агпегсз,01 садо, депоа,13, Ке 11 у, К. 1., апд О,В. сдд, 1955, Ч.Я,Оерт. Согпгпегсе С 1 гс 553.14.Тгеапег Н.О апд Е,1, Вас 1 ссв. 196235 АРР 1. Мс 1 зоЬ о 1. 11:335 - 338.15. Ргсйап, Т,С., ет. а 1. 1958. Арр М 1 сзо"Ьо 1 6:52 - 79.16. О 1 етг, А, апд 1 оЬп Маспеччв 1970. АррМ 1 сЬоЬо 1 21 - 521 - 533.(очертания 36 ясны) 0005332 ения до минимума заражений, вызываемых Вас 11- 1 цз зцЬт 11 ю.ЯМВ - спектр насыщенного раствора АТ - 125 в О,О определяли с помощью спектрометра типа Чаг ап Х - 1. - 100, Спектр, полученный на п 11 иборе с частотой 100 Мгц, не был первого порядка и ясно показывал присутствие четырех незаменяемых протонов. Протоны метилена у С 4 наблюдались в виде типичного мнимого (десерт 1 че) 5-линейного образца АВ с самым сильным сигналом при 350 гц и очевидно с дублетами при 359. и 361 гц, Соседние протоны у С, наблюдались, как очевидный дублет триплетов, сосредоточенных при 5,36 О с распреде. лением линий при 3,5 - 10 гц. Сигналом протона метиновой группы аминокислоты был дублет пер. вого порядка при 4,12 О с 7 = 3,5 гц. ИК в спек вещества в ньюеле (Мцо 1) определяли с помощью спектрофотометра типа РегЫп Е 1 аег 421. Главные пики (за исключением ньюеля) были обнаружены при 3030 (широкий), 2730, 2620, 1620, 1590, 1495, 1425, 1405, 1325, 1307, 1293, 1275, 1145, 1127, 895 и 870 смХимическая структура антибиотика АТ - 125 в кристаллическом виде была точно установлена дифракцией рентгеновских лучей, Кристаллическому антибиотику АТ - 125 можно дать химическое название . - /а 8, 58/ - а -амико- хлор- изоксаэолин-уксусной кислоты.Молекулярный вес. Точное исследование рентгеновскими лучами показывало, что антибиотик АТ - 125 имеет структурусоответствующую С 1 Н, СМ,Оз с мол. вес. 178,6.Растворимость. Растворим в воде и легко растворим в метаноле. Сравнительно нерастворим в этилацетате, простом эфире, бензоле и хлороформе,Противомикробные свойства антибиотика АТ 125.Следующие ниже результаты получали вследствие стандартного опыта с нластинчатыми дисками, причем применяли бумажные диски (размер 13 мм) и концентрацию АТ - 125 1 мг/мл.Микроорганизм Зона ингибированиявокруг бумажных днепров(в питательном агаре)1 астоЬас 111 цз савеЯагс па 1 цтеаЯтарЬу 1 ососсцв ацгецзМусгоЬастег 1 ца ач 1 цаЕвсЬег 1 сЬ 1 а со 1(испытано пои 100 мкг/мл) 38микроорганизм,Лучистьй гриб, используемый дпя полученияантибиотика АТ - 125, ЯТгертоаусез Яч 1 сецз, Однойиз характеристик его штамма является выделениеАТ - 125,Пересев живого микроорганизма был депонирован в ЙВВ. 5439. Микроорганизм изучила иохарактеризовала А 1 гпа 01 ет г сотрудник науч-но - исследовательской лаборатории ВевеагсЬ1 аЬогатогу.Описание,Ятгертоаусев зч 1 сецв О 1 етг вр.п.Цветная характеристика, При развитии на воздухе сер ьй. Меланин - положительньй. Цветныеизображения на пленках Эктахром приведены втабл, 1 11.Другие цветные характеристики приводятся втабл. 2. Культуру можно относить к серой (6 У) ибелой (И/)цветным сериям по Треснеру и Бакусу2). Микроскопические характеристики, Споры овальной до прямоугольной формы, редко украшенные выростами или короткими шипами, с подсвечникообразными спорофорами. Спорофоры длинные, прямые с завивающимися концами, Спорофоры можно относить к спиральной группе (8) по Придхаму и др, 31. Поверхность спор можно относить к бородавчатой группе по 11 иц и Мэфьюсу 4. Культуральные и биохимические характеристики,см, табл. 3 Усвоение углерода Рост культуры на углеродных соединениях определяли методами по Придхаму и Готлибу 51 и Ширлингу и Готлибу 61. В методах по Придхаму и Готлибу 8. вч 1 сецв очень хорошо рос на основной питатепьной среде, дульците, О - сорбите, салицине и оксалате натрия; хорошо на О - ксилозе, . - арабинозе, рам. позе, О - фруктозе, О - галактозе, О - глюкозе, О - маннозе, мальтозе, сахарозе, лактозе, целлоэиозе, рафинозе, декстрине, инулине, растворимом крахмале, глицерине, О манните, инозите, ацетате натрия, цитрате натрия, сукцинате натрия; плохо на феноле, формате и тартрате натрия; он не растет на крезоле и салицилате натрия. По методу по Ширлингу и Готлибу культура не растет на отрицательной контрольной среде (только на основной питательной среде). Он хорошо расте на положительной контрольной среде (основная питательная среда плюс глюкоза). Так же хорошо или лучше, чем на контрольной среде с глюкозой, он растет на основной питательной среде плюс 4 - арабиноза, сахароза, О - ксилоза, инозит, О - маннит, О - фруктоза, рамноза и рафиноза, Рост на целлюлозе точно не установлен, 503531Температура, Культура растет хорошо при 1828 оС на сахарном агаре по Беннету и Чапеку;при 18 - 37 С на мальтозноно- триптоновом агаре.(Она не растет при 45 и 55 С на сахарозном агарепо Беннету и Чалеку и на мальтозно-триптоновомагаре),Свойства относительно продуцирования антибиотика. Культура выделяет антиметаболитньйантибиотик АТ - 125.Источник. Почва Бтгертогпусеа эч 1 сеца - лучистый гриб с характеристиками пода, как изложено в 7.Культура, которую изолировали из почвы, явноотличается от видов Бгертогпусеэ, находящихся вхранилище чроЬп сц 1 тцге со 11 ест 1 оп, и насколькоэто можно определить, от видов, описанных влитературе 8.Ягертогпусеэ вн 1 сеца показывал некотороесходство с БтгерТопусеа Ьачча 11 епэ 1 а 9. АТСС122236. Обе культуры реагируют положительно намеланин и имеют сходные свойства усвоения углерода в синтетической питательной среде по Ппидхаму и Готлибу. Бтгертогпусеэ Ьачча 11 епэ 1 я имеетоткрытые спиральные спорофоры, более короткиеи менее выраженные, чем спорофоры новой культу.ры, которые длинны с завивающимися концами, Какнаблюдалось в электронном микроскопе в проходящем свете, споры имеют круглую до овальнойформы и покрыты тонкими шипами, что касаетсяБ. Ьачча 11 епйэ и овальную до прямоугольной формы с поверхностью, редко покрытой бородавкамии шипами. Отличительные характеристики Б. Бч 1 сецэ приведены в табл. 4.Благодаря характерным цветным иэображе.лиям и микроскопическим характеристикам Б,Бч 1 сецэ легко отличать от характеризованных видов Бтгертотусеэ в хранилище чройп сц 1 тцге со -1 ес 6 оп и, насколько это можно определить, откультур, описанных в литературе, Культуральныехарактеристики, приведенные в таблицах, подчер.кивают отличительные черты Б. Бч 1 сецэ. Уникальное свойство этого организма заключается в егоспособности выделять антибиотик АТ - 125. Предлагается рассматривать организм, который здесь характеризуется, как новьй вид Бтгертощусев, называемьй Бтгертогпусея эч 1 сець (от чешского словаэн 1 се или зч 1 сеп, означающего свеча или подсвечник - спорофоры культуры подсвечникообразны01 етг, эр и. Тип вида получил название разнпвидности Бтгертогпусеэ ач 1 сеца чаг, ач 1 сецв в соот.ветствии с Правилом 9 д (2) Международного номенклатурного кода для бактерий 110 .Предлагаемое соединение получают выращиванием вырабатывающего его организма в глубиневодной питательной среды в аэробных условиях,Для получения незначительных количеств соедине.ния можно испольэовать и культуры на поверх.ностном слое жидкости. Гриб растет в питательнойсреде, содержащей источник углерода и усвояемоеазотистое соединение или белковое вещество, Пред почтительные источники углерода; глюкоза, неочищенный сахар, сахароза, глицерин, крахмал, ку. курузньй крахмал, лактоза, декстрин, меласса и т.п. Предпочтительные источники азота - кукурузньй экстракт, дрожжи, автолизированные пивоваренные дрожжи с твердыми частицами молока, соевая мука, хлопковая мука, кукурузная мука, твердые часпщы молока, панкреатический перевар казеина, барда, пептонные жидкости животного происхождения, отходы мяса и костей и т.п. Целесообразно использовать углеродистые и азотистые вещества в комбинации. Так как используют водопроводную воду и добавки в неочищенном состоянии, то отпадает необходимость в добавлении мик роэлементов, таких, как цинк, магний, марганец, кобальт, железо и т.п., к ферментационной среде.Новое соединение получают при любой температуре, пригодной дл.ч обеспечения роста гриба, например 18 - 40 С, предпочтительно 20 - 32 С. Максимум выработки соединения, как правило, достигается через приблизительно 2 - 10 дней. Значение рН во время ферментации обычно слабо - кислое. 5 10 15В случае выращивания в больших сосудах и сборниках целесообразно использовать для посева скорее вегетативную, чем спороносную форму во избежание выраженного замедления выработки нового соединения и связанного с ним неэффек. тивного использования приборов. В связи с этим желательна выработка вегетативного инокулума в питательной бульонной культуре засевом ее алик. вотным количеством почвенной культуры или культуры на скошенном агаре. Полученньй таким образом молодой, активный вегетативный инокулум переносится в асептических условиях в большие сосуды или сборники. Среда,в которой вырабатывают вегетативньй инокулум, может соответствовать среде, используемой для получения нового соединения, или отличаться от нее в зависимости от обеспечения хорошего роста грибка.Антибиотик АТ - 125 является амфотерным соединением. Он растворим в воде и малорастворим я СНЗОНВ целях выделения и очистки АТ - 125 можно пользоваться различными способами, например абсорбцией с последующим вымыванием подходящим растворителем, колоночной и распределительной хроматографией, кристаллизацией из раст. ворителей.АТ - 125 предпочтительно рекуперируют иэ питательной среды фильтрацией через кизельгур сред. ней пористости, напримеп, 40 ф - мы Игль Пичер, Другие для этих целей пригодные сорта кизельгураэто, например, известные под торговыми названиями Бцрег Се (.1 оЬпэ гпапч 1 Ь 11 пе Йатогп 1 те), О 1 са 11 е 4200 (бгеаФ 1 аМеа, М 1 гайо 40 (гаде Рс-. Ьег,) (5,5 - 7,0), Конечное значение рН отчасти зави сит от наличия буферов, если они вообще при 60 25 30 35 40 45 5055 сутствуют, отчасти от начального значения рН питательной среды, которое целесообразно установитьперед стерилизацией приблизительно до 7,0,В случае осуществления выращивания в боль.ших сосудах и сборниках целесообразно использовать для посева скорее вегетативную форму, чемспороносную форму, во избежание выраженногозамедления синтеза нового соединения и связанногос ним неэффективного использования приборов. Всвязи с этим желательная выработка вегетативногоинокулума в питательной бульонной культуре засе- Овом ее аликвотным количеством почвенной культуры или культуры на скошенном агаре. Полученный таким образом молодой, активньй вегетативньй инокулум переносится в асептических условиях в большие сосуды или сборники. Среда, в 15которой вьпрабатывают вегетативный инокулум,может соответствовать среде, используемой дляполучения нового соединения, или отличаться от неев зависимости от обеспечения хорошего ростагрибка. 20Новый антиоиотик АТ - 125 является амфотер.ным соединением, Он растворим в воде и малорастворим в СН,ОН.В целях выделения и очистки АТ - 125 можнопользоваться различными способами, например 25абсорбцией с последующим вымыванием подходящим растворителем, колоночной и распределительной хроматографией, кристаллизацией из растворителей.АТ - 125 предпочтительно рекуперируют из пи- з 0тательной среды фильтрацией через кизельгур средней пористости, например 40 ф - мы Игль Пичер.Другие пригодные для этих целей сорта кизельгураэто, например, известные под торговыми названиями Яцрег Се (оппз Магв 11 з тпе с 1 атоп 1 те, З 501 са те 4200 (бгеат 1.аКез, К 1 га 1 о 40 (Еад 1 еРсЬег,.Прозрачная исчерпанная питательная средафильтруется через хроматографическую колонку снасадкой из стирольной смолы с сульфокислотными остатками. Предпочитают водородную формуОовех 50, в частности плотно сшитый, напримерОсаех 50 х 16 Яругими пригодными смолами яв.ляются извесгные под торговыми названиями Ап 1 Ьег 1 те 1 В 12 Масте НСВ, СЬетрго С - 20, Регпцт 1 т О, ЕеокагЬ 225.После промывки колонки антибиотик вымывается основанием, в частности ИНаОН. Содержа.щие -антибиотик элюаты собирают, концентрир ют.По предпочтительному способу очистки выше 50описанный водньй концентрат прй значении р6,2 - 7,8 фильтруется через колонку с насадкой изслабоосновной стирольнополиамидной смолы, причем предпочитают АвЬег 1 те 1 В 45 (ОН 1, Другиепригодные смолы - это, напримергАпаег те 1 В 4 В, 55Йа 1 сйе ВВВ, ОеАсс 1 те Е. Оцо 1 те А,2.Колонку промывают деионизированной водой,50%-ным водным раствором МеОН и 90%.нымводным раствором МеОН, а затем вымывают 0,1 н,уксусной кислотой в 90%.ном растворе МеОН. 401501 л йаМоОа 2 Н О 200 мкг/мл Активные элюаты собирают и при уменьшенномдавлении выпаривают досуха, МеОН можно заменить Н,О,Полученный остаток подвергают распределительной хроматографии, предварительно растворивего в нижней фазе системы растворителей, состоящей из смеси н - бутанола, бензола, метанола идеионизированной воды (2:11). Нижнюю фазу,содержащую остаток из колонки с насадкой изслабоосновной стирольнополиамидной смолы, гомогенизируют кизельгуром средней пористости,например, ф - мы Еаде РсЬегз Ей 40, и верхнейфазой системы растворителей, Полученный гомогенизированный твердьй материал подают на колонку, содержащую кизельгур средней пористостии предварительно приготовленную взвешиваниемкизельгура в верхней фазе описанной выше смесирастворителей, тщательно смешанной с нижней фазой, выливанием в хроматографическую колонку и,наконец,тем, что слою дают осесть, пока верхняяфаза проходит через колонку, Активные элюаты изколонки собирают, объединяют и выпаривают досуха. Кристаллический АТ - 125 получают кристаллизацией подходящим растворителем, предпочтительно метанолом. Можно применять и 95%-ныйэтанол, водный бутанол и воду.Другой способ рекуперации АТ - 125 из фильтрованной исчерпанной ферме нтационной средысостоит в абсорбции на подходящей ионообменнойсмоле, напр. Ооеех 1 (ОАС) при рН 9 - 10 или 1 Я45 (ОН - ) при рН 6 - 7. После промывки смолы Н ОАТ - 125 получают вымыванием водным или метанольным КНаОН или уксусной кислотой, Далеефильтрованную прозрачную исчерпанную ферментационную среду можно абсорбировать на угле,после чего АТ - 125 вымывают соответствующейсмесью растворителей, например водным ацетоном.По другому способу очистки можно хроматографировать на силикагеле метанолом в СНС 1, илиСН С 1, или смесями бензола (или толуола),95% - ного этанола и уксусной кислоты.Титр АТ - 125 в исчерпанной питательной средев отдельных стадиях рекуперации контролируюттестом с культурой Васцап ЗцЬт 11 з, разведенной вчашках Петри на синтетической среде следующегосостава, г:йа, НРОа 7 НгО 1,7КН РОа 2,0(11 Н) БО 1,0Мдзса 0,1Глюкоза 2,0Васто Адаг формыО1.сос 1 а Ьогат о г 1 евОетго 1 т М 1 сЬ 1 дапДистиллированная водаОсновной раствор с ионамиметаллов 1 мпОсновной раствор с ионами металлов состоитиз:СоС гСо 50Мп 504СаСЕеСг 4 НгО7 пСг 100 мкг/мл100 мкг/мл 2 мг/мл 25 мг/мл 5 мг/мл 5 мг/мл 7 пС 1, должет быть растворен отдельно с применением капли 0,1 н. НС на 10 мл воды. Основнойраствор нагревается до растворения всех соедине.ний, выдерживается сутки и фильтруется в стерильных условиях.Эта среда эасевается суспенэией спор 3, ЯоЬт 1 гв(1,51 О о клеток/мл) с концентрацией 0,5 мл/л.Пробы исчерпанной питательной среды наносятся надиски адсорбирующей бумаги диаметром 12,5 мм(0,08 мл/диск), диски инкубируются в течениеночи при 37 С, а затем измеряются зоны ингибирования, Соотношение между активностью пробы идиаметром зоны ингибирования вычисляется с помощью обычных стандартных кривых,Засеянную В БоЬт 1 з среду можно также испольэовать для обнаружения антибиотика АТ - 125.Хроматограммы на бумаге проявляются верхнейфазой смеси растворителей, состоящей из и - бутанола, метанола, бензола и воды (2:11:1). Послепроявления высушивают бумагу и кладут бумажные хроматограммы на прозрачные тарелки, содержащие засеянную среду и снимают их примерночерез 20 мин, Тарелки инкубируют в течение ночи,как выше указано, а затем определяются зоныинги бирования.Так как антибиотик АТ - 125 является амфо.терным соединением, он образует соли с кислотами,щелочными металлами (включая аммоний) щелочноземельными металлами (включая магний и алюми.ний) и аминами. Соли с металлами получают растворением АТ - 125 в воде и добавлением разбавленного основания металла до достижения значения рНраствора 7 - 8. Соли АТ - 125 с металлами включаютсоли с натрием, калием, кальцием, Аминные соли,включая соли с органическими основаниями, таки.ми как первичные, вторичные и третичные, моно - ;ди - и полиамины можно также получать, используяуказанный выше или другие общеизвестные способы, Далее, аммониевые соли можно получать общеизвестными способами, Другие соли получают сэффективными с терапевтической точки зренияоснованиями, обусловливающими дополнительныетерапевтические эффекты. К таким основаг ямотносятся, например, пуриновые основания, такиекак теофиллин, теобромин, кофеин или производ.ные таких пуриновых оснований; антигистаминовые основания, способные образовать соли сослабыми кислотами; пиридиновые соединения,такие, как амид никотиновой кислоты, гидразидиэоникотиновой кислоты и т.п.; фенилалкиламиены, такие, как адреналин, эфедрин и т.п.;холин и др.Кислые соли получают нейтрализацией АТ - 125соответствующей кислотой, доводя значение рН521010 10 Значение рН до стерилизации доводится до 7,2 при помощи 4 н. 1 чаОН. Фермеитационнью колбы засевают ииокулумом в количестве 5 мл/100 мл ниже 7,0, предпочтительно до 2 - 6. Подходящимикислотами являются хлористоводородная, серная,фосфорнаясульфаминовая, бромистоводородная ит,п, Кислые и основные соли АТ - 125 можно применять для тех же самых биологических целей, что иисходное соединение,ЛТ 25 действует на ЕзсЛегсЬа со 1 и служитдля уменьшения, торможения и прекращения выде.ления слизи на целлюлозно - бумажных заводахблагодаря своей противоЬактериальной активности,АТможно также использовать для продленияжизни культур ТгсЬогпопаз 1 остцз, ТгсйовопазЬопия, ТгсЬовопаь Ча 9 паз, так как он освобождает их от ЕзсйегсЬа со 1, Далее, АТ - 125можно использовать в качестве фунгицида для обра.ботки кожи для верха обуви по патенту СШАУ 3130505. Так как АТ - 125 действует на ВасоззоЫ 1 з его, кроме того, можно еше использоватьдля доведения до минимума или предотвращениязапаха рыбы или ящиков для рыбы, вызываемогоэтим микроорганизмом. АТ - 125 можно использовать также для очистки столов и оборудования вмикологических лабораториях.АТ - 125 действует на 11.210, вызывающий влабораториях лейкемию у мышей, и поэтому егоможно использовать для их лечения.П р и м е р 1, А, Ферментация. Штамм Ргерто,- аусеа ачсеоз, МВ В 1. 5439, из почвы используют длязасева колб Эрленмейера емкостью 500 мл, содержвщих 100 мл стерильной среды, состоящей изследующих компонентов, г/л:Декстроза 25 г/лФармамедиа+ (продукт фирмыТгадегза р 1 М 11 Соарапу,35 Еог 1 %агтрк Техаз) 25 г/лВодопроводная вода до 1 лДо стерилизации среда, предназначещая дпязасева, имеет значение рН 7,2. Инокулум выращи.вают в течение 2 суток при 28 С во вращающемсявстряхивателе по Гампу (250 об/мин), Инокулум,йриготовленный указанным выше образом, применяют для засева колб Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащих 100 мл стерильнойферментационной среды, состоящей из следующих45 компонентов, г/л:Карбонат кальцияХлорид натрияКрахмалМаннит50Фитон (папаиновыйперевар соевой муки) 10КэйСой (тонко измель.ченная обезжиренная соевая мука)55 Олеомаргарин из свиногосала 1 мл/100 мпВодопроводная вода до 1 л,ферментационной среды. Ферментационные колбы выдерживают 2 - 3 суток при 32 С во вращающемся встряхивателе по Гампу (250 об/мин). Максимальная выработка АТ - 125 в ферментационной колбе, как правило, достигается через день после начала выделения по каплям титра антибиотика. Приведен. ная ниже зависимость типична для ферментационного процесса в колбе - встряхивателе,Время, ч Бе/мл АТ - 125 48 5672 2296 26120 16 Биоединица активности (Бе) определяется какколичество антибиотика, требуемое для получениядеадцатимиллиметровой зоны ивгибированиядиском диаметром 1,5 дюйма, обработан.ным 0,08 мл раствора антибиотика, Тест с дискомпроводят, как выше указано,Б, Рекуперация,Всю исчерпанную питательную среду (250 л),оставшуюся от ферментации АТ - 125, фильтруют,как выше указано, через кизельгур средней пористости. Образующаяся прозрачная исчерпаннаяпитательная среда при значении рН 7 - 8 фильтруетсячерез хроматографическую колонку с 25 л свежерегенерированного Ооиеех 50 16 (Н+), Колонкупромывают 50 л деионизированной Н О и вымы.вают 120 л 1 н. ИН 4 ОН; затем собирают фракциипо 6 л, Самая активная фракция (зоны ингибиро.вания ) 50 мм) определяется нанесением смоченных и высушенных на воздухе дисков на тарелку сВас 11 цз зцЬт 1 з, выращенным в синтетическойсреде, как выше указано. Активные фракцииобъединяют и концентрируют при пониженном давлении в целях удаления избыткаМН 4 ОН. Определение твердого материала показывает, что сыройводный концечтрат содержит 2950 г, а активныеэлюаты 244 г. Тверпьй материал в активных элюатах приблизительно в 13 раз активнее по отношению к Вас 1 цз зцЬт 1 з, чем твердый материал,содержащийся в прозрачной исчерпанной питатель.ной среде,В. Очистка.(1) Колонкой иэ слабоосновной стирольнополиамидной смолы.Активный в одньй концентрированньй элюат изОоаах - 50, полученный, как выше описано, призначении рН 7 - 7,5 фильтруется через колонку, со 15 20 25 30 35 40 45 50 держащую 4 л АвЬег 1 те 1 В 45(ОН ). Колонку промывают 8 л деионизированной Н, О 4 л 50 о-ного водного МеОН и 8 л 90 о-ного водного МеОН, а затем вымывают 0,5 н, уксусной кислотой в 90%-ном МеОН; собирают фракции по двум литрам. Самые активные фракции относительно Вас 1.- 1 цз зц 1 т 1 з объединяют и выпаривают досуха при пониженном давлении; выход составляет 9,40 г остатка с активностью относительно Вас 1 цз зцЬт 1 з, превышающей активность остатка описанного выше элюата из Оовех - 50 в 28 раз(2) Распределительная хроматография,Смесь н - бутанола, бензола, метанола и деионизированной воды (2:1:1:1) перемешивают, затем смеси дают разделиться на два слоя; слои разделяют, Кизельгур средней пористости (2340 г) взвешивают в верхней фазе, тщательно перемешивают с 900 мл нижней фазы, а затем выливают в хроматографическую колонку и дают слою осесть, пока верхняя фаза проходит через колонку. Остаток элюата из 1 В 45, полученного, как выше указано, растворяют в 25 мл нижней фазы и гомо. генизируют 75 г кизельгура средней пористости и 50 мл верхней фазы. Получаемый гомогенизированньй твердьй материал тщательно подают на колонку и начинают вымывание верхней фазой; собирают фракции по 500 мл, Самые активные относительно Вас 1 цз зцЬт 1 з фракции выпаривают досуха при пониженном давлении, что дает 3,93 г остатка, активность которого относительно Вас 11 цз зцЬт 1 з превышает активность описанного выше остатка элюата из 1 В 45 в 2,9 раз,(3) Кристаллизация.Описанньй остаток, полученньй распределительной хроматографией, кристаллизуют из СНз ОН и перекристаллизуют иэ водного СНЗ ОН 3 раза, что дает 362 мг чистого кристаллического АТ - 125, активность которого относительно Васцз зцЬт 1 а превышает примерно в 4 раза активность высокоактивного остатка, полученного в результате описанной выше распределительной хроматографии,Соли антибиотика АТ - 125 можно получать по описанным способам. Эти соли, как указано вьппв, служат для тех же целей, что и исходный анти. биотик,Вышеизложенное изобретение было сделано в рамках контракта РН 43 - йС - 69 - 1023 с Матопа 1 сапсег 1 пзттцте, йатопа 1 пзттцтез от Неатп, ВетЬезда, Магуапд Л 3014,503531 14 13 Габлиыа 1 Агаровая среда Обратная сторона Лицевая сторо Лавандово - серая Не растет на воздухеСветло - лавандово - серая БеннетаСахароза ЧанекаМальтозно-триптоноваяПептонное железоТирозин (концентрация 0,1%)Казеиновый крахмал Цветные изображения Бтгертопусез зчсеоз на пленке ктахром 11)Щ д о 6 ид Й з В Е Е д Р йо Я о 3 ф йф ощ 3дЯ Ооо воЕ ввЯ Зфо 3 о о Б о,д щ 6 д О М Я Е в,4 Ха ая 0 мо1о оф фо ооо