Способ стабилизации уреазы в растворе

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛ ИСТИЧЕСКРЕСПУБЛИК 9) И ю 4 С 12 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 835242/31-132.01.850.04.8. Бюл. Ф 16нститут биохимии А,Ю,Кулис и Б.С.Кур57.15(088.8)упп К.К, Бове Ргорсае 1 оп оХ цгеаве.раув. АсТа, 1967,(21) (22) (46) (71) И (72) Ю (53) (56) 1, Ригой ег В 1 о ЛитССРнайтене г 1 ев апосЬеш .46, 205 извод ка на Промышленная методи ство ферментного прела Вильнюс, НПО ферментАвторское свидетель В 743600, кл. С 0 1 И 3 за. рата уре 1982. ство ССС 1/22, 1954) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИАСТВОРЕ УРЕАЗЫ В ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(57) Изобретение относится к способам стабилизации ферментов, содержащих БН-группы, а именно к способу стабилизации уреазы в растворе. Цель изобретения - упрощение и удешевление способа а также удлинение срока сохранения активности фермента. Сущность изобретения заключается в том, то после обработки сефадексом к раствору уреазы в 0,01-0,06 М натрийфосфатном буфере добавляют в качестве стабилизатора зтилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) при соотношении 1:1-3 и дополнительно - сульфит натрия в количестве 10-100 мИ. Способ прост по технологии и позволяет удли- аЮ нить срок хранения фермента в раство.0 ре при 25 С, 1 табл.40 45 50 55 Изобретение относится к способам стабилизации ферментов, содержащих БНгруппы, а именно к способу получениястабилизированной уреазы, которая находит применение при определении мочевины.Фермент уреаза нестабилен при длительном хранении в холодильнике иликомнатной температуре Хранение уреазы в растворенном виде приводит кбыстрой потере активности Фермента,что снижает воэможность его использования для анализа мочевины в биологических жидкостях,Цель изобретения - упрощение иудешевление способа, а также удлинение срока сохранения активности фермента.Способ осуществляют следующим образом.К раствору предварительно обработанной сефадексом уреаэы в Фосфатном буфере в качестве стабилизаторапомимо 1 мм этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) добавляют сульфитнатрия в количестве 10-100 мМ. Величина рН раствора 6,8. Она являетсяоптимальной для активности уреазы иподдерживается 0,01-0,06 М натрийфосфатным буфером.Эффект стабилизации в присутствиисульфита натрия обусловлен тем, чтоон восстанавливает частично окисленные при хранении ЯН-группы уреазы.Сульфит натрия не может быть замененкаким-либо другим анионом по тойпричине, что сульфит вступает в реакцию расщепления Б-Б связи (в данномслучае смешанного дисульфида белкаи меркаптоэтанола) с освобождениемЯН-группы. Внутренние Б-Б связи белкаимеют низкую реакционную способностьпо отношению к сульфиту из-за стерических помех. Влиянием стерическихфакторов объясняется предпочтительнаяатака сульфит-иона на одном из атомовсеры в несимметричных дисульфидах. Реакцию восстановления дисульфидной связи осуществляют и другие реагенты: гидрид-ионы, арсенит, цианид, тиосульфат и др. Однако сульфит является более реакционноспособным, чем тиосульфат, и неядовит в отличие от цианида, арсената и др. Гидрид-ион может разрушить и внутренние Б-Я связи вследствие высокой реакционноспособности. 5 10 15 20 25 30 35 Другое использованное свойство сульфита - способность удалять из раствора фермента кислород.фермент уреаза является белком с четвертичной структурой, поэтому стабильность в некоторой мере зависит от ионной силы буфера. Известно, что при концентрации фосфата натрия в буФере 0,01 М активность уреазы составляла 14 ед/мг (63 ), а при концентрации 0,06 М - 22 ед/мг. При увеличении концентрации Фосфата выше 0,1 М активность несколько уменьшается и составляет 80-907.Стабилизирующее действие этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) объясняется тем, что она связывает ионы металлов, являющихся катализаторами окисления, молекулярным кислородом важных для активности фермента тиоловых групп,Предварительная обработка уреаэы сефадексом согласно известному способу обеспечивает обессоливание фермента и удаление неподдающихся стабилизации примесей вследствие чего повышается начальная активность подвергаемой стабилизации уреазы (от активности продажной уреазы 30-50 до 90 и более Е/мг), а также ее стабильность.Предлагаемый способ стабилизации уреазы, являющийся более простым по своей технологии осуществления и более дешевым по используемым в качестве стабилизаторов веществам, позволяет удлинить сроки сохранения урео азной активности в растворе при 25 С. П р и м е р 1. 100 мг продажной уреазы растворяют в 3,5 мл 60 мМ фосФатного буфера, рН 6,8, фильтруют через колонку, заполненную 150 мл геля сефадекса( =200, предварительно уравновешенного фосфатным буфером рН 6,8, содержащим 1 мМ ЭДТА и 1 мМ меркаптоэтанола (МЭ). Элюируют тем же буфером. Активную Фракцию подвергают стабилизации и испытанию на стабильность при хранении при 25 С. Конто рольный образец (1 мл очищенной уреазы,концентрация которой 0,2 мг/мл разбавляют 9 мл Фосфатного буфера рН=6,8.Для стабилизации берут 1 мл раствора очищенной уреазы (концентрация 0,2 мг/мл, удельная активность 90, 1 Е/мг), к нему прибавляют 9 мл фосфатного буферно-о раствора (60 мМ, рН 6,8), содержащео 1 мМ ЭДТА и от 1(в 7 от начальной) от концентрациисульфита натрия при хранении приведена ниже. до 100 мМ сульфита натрия, и расто вор оставляют в термостате при 25 С. Периодически измеряют активность уреазы, отбирая по О, 1 мл раствора. Концентрация1 Яа БО, мМ 0 1 2 10 20 30 50 100 62 65 86 90 89 100 99 92 Уреазная 4 сутактивность после хранения 120 сутпри 25 С, 7 4,3 -- 32,9 - 43 - 40 Наибольший стабилизирующий эффект15 дает применение сульфита натрия в интервале концентраций от 10 до 100 мМ: на 4-е сут хранения активность уреазы почти не меняется, после 4-месячного хранения остаточная активность составляет 33-433. В то же время контьрольный образец после 4 сут теряет 383 начальной активности, а после 4 месяцев она составляет только 4,3 Х, Время полужизни препарата, содержащего сульфит натрия в концентрации 30 мМ и сохраняющего 437 уреазной активности после 4-месячного храненияопри 25 С, составляет 96 сут. Дальнейшее увеличение концентрации стабилизатора приводит к подщелачиванию среды и, следовательно, к снижению уреазной активности из-за несоответст- :. вия рН раствора рН-оптимуму фермента. оВремя хранения при 25 С, сут Состав среды 0 2 7 15 41 53 35,9 29,5 4,08 1,89 0 100 1 Вода2 30 мИ Иа ЯО Н 0 20,8 37,4 35,7 100 100 100 3 30 мМ Ма 80 1 мМ ЭДТА Н 20 100 100 83,3 58,2 41,7 100 14,4 11,7 20 18,8 23,2 100 64,2 74,1 85,2 76,5 100 100 100 - 42, 7 27, 7 26,6 30 Из таблицы видно, что при добавлении стабилизирующих компонентов 4 1 мМ МЭ 1 мМ ЭДТА НО 5 30 мМ Иа БО 1 мМ ЭДТА 60 мМ Иа-Р буф. рН 6,8 6 Глутатион, тринатрий цитрат, ЭДТА, уреаза (1:1:1:1), вес.ч., Н О П р и м е р 2. 100 мг сухой уреазы очищают на колонке с сефадексом 1 =200 аналогично примеру 1. К 0,5 мл очи- . щенной уреазы (концентрация О, 15 мг/мл, уд. активность 70, 1 Е/мг) приливают воды до 10 мл (раствор 1 - контрольный препарат). Аналогично готовят ферментные препараты в растворах 2-5, в которых содержатся различные стабилизаторы. Стабилизированный состав по прототипу растворяют в воде (препарат 6), Все образцы подвергают испытанию на стабильность при хранении в термостате при 25 С. Состав растворов, время хранения и уреазная активность в 2 от начальной приведены в таблице.1306953 Составитель Е,ВоробьеваРедактор М.Бандура Техред В.Кадар Корректор А.Зимокосов Заказ 1498/24 Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, уч.Проектная, 4 торого содержится сульфит натрия иЭДТА в натрий-фосфатном буфере, рН6,8, теряет 507 начальной активности при 25 С в течение 82 сут. Фероментные препараты в составах 2 и 3,содержащих соответственно толькосульфит натрия в воде или сульфитнатрия и ЭДТА в воде, являются менеестабильными по сравнению с Ферментным препаратом в составе 5, При от Осутствии сульфита натрия (раствор 4)стабилизирующий эффект еще меньше.Контрольный образец уреазы, растворенной в дистиллированной воде (состав 1), теряет половину активности 15менее чем эа 12 ч,Таким образом, стабильность уреаэы в растворе 5, приготовленном согласно изобретению, превышает ее ста бильность в растворах, содержащих от-дельные компоненты. Она также в 2 раза превышает стабильность состава по прототипу в водном растворе (препарат 6). 25Стабилизированную предложенным способом уреаэу использовали для приГотовления ферментной уреазной мембраны, применяемой при определении мочевины. ЗОП р и м е р 3, Приготавливают 3 образца уреазных мембран по известной методике. Уреазу предварительно очищают на колонке с сефадексом 1=200 (как указано в примере 1), 35 затем смешивают ее с раствором бычьего сывороточного альбумина в фосфатном буфере следующим образом:Образец 1: 100 мг альбумина;0,7 мг (0,2 мл) уреазы; 401,0 мл (10 мМ Ма-фосфатного буфера рН7,0-7,2. Образец 2: 100 мг альбумина;0,7 мг (0,2 мл) уреазы;1,0 мл 10 мИ Иа-Фосфатного буфера рН 7,0-7,2;мМ меркаптоэтанолаи 1 мМ ЭДТА.Образец 3: 100 мг альбумина;0,7 мг (0,2) уреаэы;1,0 мл 10 мИ На-фосфатного буфера рН 7,0-7,2;30 мМ Ма БО и 1 мИ ЭДТА.В каждую иэ трех смесей добавляют по 0,03 мл 253 глутарового альдегида. Полученную смесь выливают на стеклянные пластинки размером бхб см и оставляют для иммобилизации в холодильнике при +4 С в течение 5 ч, после чего готовые мембраны промывают водой и хранят в холодильнике каждую мембрану в буферном растворе с соответствующими добавками. После 4-месячного хранения при 4 С проверяютоуреазную активность: мембрана 3 сохранила 967 начальной уреазной активности; мембрана 1 - 423, а мембрана 2 - 327 начальной активности. Формула. изобретенияСпособ стабилизации уреазы в растворе путем добавления к исходному ферменту, предварительно обработанному сефадексом, в качестве стабилизатора этилендиаминтетрауксусной кислоты при соотношении фермента и ЭДТА 1:(1-3), о .т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и удешевления способа, а. также удлинения срока сохранения активности фермента, исходный Фермент помещают в 0,01- 0,06 М натрий-фосфатный буфер а в полученный раствор в качестве стабилизатора дополнительно вводят сульФит натрия в количестве 10-100 мМ,