Способ получения малатдегидрогеназы из митохондрий головного мозга

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК К АВТОРСКОМ ТЕЛЬСТВ ельно при и 6,8-7,2. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИ ИСАНИЕ ИЗОБ(71) Горьковский государственныймедицинский институт им,С.М.Кирова(56) 1,С 1 аггЬааг а 1. ТЬе ргерагаг 1.оп оГ где сугор 1 аяахс апй пагоЬопйгда 1 Еогшя оЕ ша 1 асейеЬуйго 8 епавеапй аврагтаге ашпоггапяЕегаве,Егошр 8 Ьеагг. Ьу а вп 81 е;ргосейцге"Апа 1 уса 1 Вос 1 цппвгу", 1974чо 1.57, р.432-451.2.Каяйчашайа Я., Бхцыа Г.,КаоЬ К., Н 18 аяЬЫа Н Ма 1 аге4 еЬудго 8 епаяе ог йочдпе.,сегеЬ.цшпЬдМдоп Ьу Ь 11:гцЬхп,Лоцгпа 1 оЕМецгос 1 цш 1.вегу," 1975, чо 1.24,р.89-191. 801165402 А(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ МИТОХОНДРИИ ГОЛОВНОГОМОЗГА, включающий выделение митохондрий и очистку фермента с помощью ионообменной хроматографии, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения способа и повышения чистоты фермента, очистку фермента проводят с помощью хроматографии на катионите "Биокарб", при этом сорбциюпроводят при рН 5,9-6,1, а промывкуи десорбцию - фосфатным буфернымраствором последоватрН 5,9-6,2; 6,3-6,7Изобретение относится к биохимиии касается способов получения ферЬ тмента калатде Гидро Геназы из митахондРрий ГСЛОВИОГО маз Га о,Известен способ получения малатдегипрогеназы из ткани сердца Включающий гомогенизирование ткани,отделение супернатанта, высаливаниесульс 1 атом аммония Отделение осадка,его перерастворение диализ, хроматографию на колонке с карбоксиметилцеллюлазаЙ получение фракций с малатцегидрогеназнай активностью, диализ Фракций, хроматографию на колонке с сефадексам д11 .Недостатками способа являютсяега многастадийнасть, относительнонизкая чистота целевого продукта,НИЗКИИ ВЫХОДоИзвестен сгособ получения малатдегидраГене.зы из митахОндрий ГОЛОВного мозга, ,включающий Выделение митохондрий и очистку фермента с помощью ианасбменной хроматографии 21,К недостаткам известного способаотносятся ыокая трудоемкость и многастадийнасть процесса получения целевогс продукта и его низкая удельная активность,Целью изобретения является упрощение спссоба и повышение чисто-.ты целевого продукта.Поставленная цапль достигается тем, что псн способе получения малатдегидрагеназы иэ митохондрий головного мозга, включающем выделение митаходрий и очистку Фермента с помощью ионоабменной хроматографии, очистку фермента проводят с помощью хроматографии на катионите Биакарб, при этом сарбцию про- ВОДЯТ при ВН 5.9-6,1, а промыВку и десорбцнк - фосфатным буферным раствором последовательно при рН 5,9-6,2; 6,3-6,7 н 68-,2.П р и м е р 1 Из головного мозпалучают митохондрии по методу Фонье и Шомадьи. Общий белок 4900 мг обща активнОсть 27440 ед удельна активность 5,6 ед/мг белка. Фракцию митохондрий суспендируют в 0,7 М сахарозе (рН 7,4) да концентрации, О мг/мль Затем праВОДят центрифугирование в градиенте плотности сахаразы (0,7:1,2:1,5 М) при 60000 Р в течение 2 ч. Осадок представляет собой обогащенную Фракцию митохондрий, Общий белок 8 мг, общая активность 7811 ед, удельная активность - 11 ед/мг белка, Митохондрии очищенные от миелина и синаптосом, суспендируют в0,01 М фосфатном буфере рН 7,4 и разрушают в гомогениэаторе типа Блендар при 3000 об./мин. Полученныйгомогенат центрифугируют при 150000 8 в течение 60 мин для полного освобождения раствора ат митохондриальных мембран. Супернатант отделяют от Осадка, его общий белак 286 мг, общая активность6581 ед, удельная активность23 ед/мг белка. Доводят рН супернатанта до 5,9 О,М соляной кислотой и центрифугируют при 10000 яв течение 10 мин, Общий белок полученного супернатанта, 115,2 мг,Общая активность 3918 ед, удельная активность 34.ед/мг белка.Супернатант пропускают черезстеклянную колонку, заполненнуюкатионитом "Биокарб" (внутреннийдиаметр колонки 1,7 см, объем сорбента 4,09 см ), со скоростью88 мл/ч, По окончании сорбции колонку промывают водой да исчезновениябелка в промывных водах (контрольна белок осуществляют спектрофатометрическим методом по оптическойплотности раствора при длине волны280 и 260 нм),Десорбцию проводят ступенчатым градиентом рН тремя 0,1 М фосфатными буферами с рН 5,9; 6,3 и 6,8. Скоростьдесарбции 44 мл/ч, Сначала пропускают 50 мл буфера с рН 5,9, затем50 мл с рН 6,3 и наконец 120 мл срН 6,8, На выходе из колонки отбираются Фракции по 15 мл, в которыхопределяются рН, концентрация белка (спектрафатометрическим методоми по методу Лаури) и активностьмалатдегидрогеназы (спектрафотометрическим методом), фракции с удельной активностью выше 1000 ед объединяют, Объем активных фракций76 мл, общий белок 1,23 мг, общаяактивность 3087,3 ед, удельная активность 2510 ед/мг белка,П р и м е р 2, Получают митохондрии иэ головного мозга по методуФонье и Шомодьи. Общий белок4640 мг, общая активность 26912 ед,удельная активность 5,8 ед/мг белка. Фракцы митохондрий суспенди"руют 0,7 М раствором сахаразы28386 ед, удельная активность5, ед/мг белка, Митохондрии суспендируют в 0,7 М сахарозе и центрифугируют в градиенте плотностисахарозы (0,7:1,2:1,5 М) при60000 8 в течение 2 ч. Осадок представляет собой обогащенную митохондриальную фракцию, очищенную отмиелина и синаптосом. Общий белок723 мг, общая активность 953 ед,удельная активность 11 ед/мг белка. Очищенные митохондрии суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,4 и разрушают в гомогенизаторе типа Блендор при 13000 об./мин в течении 5 мин, Гомогенат центрифугируют при 150000 8в течение 60 мин для осаждениямитохондриальных мембран, в дальнейшем работают с супернатантом.Общий белок 281 мг, общая активность 5901 ед, удельная активность2 ед/мг белка, Доводят рН супернатанта до 6,1 0,1 Н соляной кислотой и центрифугируют при 10000 дв течение 10 мин. Общий белок полученного супернанта 123 мг, общаяактивность 4059 ед, удельная активность 33 ед/мг белка,Супернатант пропускают черезколонку, заполненную сорбентом"Биокарб" (внутренний диаметрколонки 1,7 см, объем сорбента 4 см )со скоростью 88 мп/ч. По окончании сорбции колонку промывают водойдо исчезновения в промывных водахбелка (контроль на белок осуществляют спектрофотометрическим методомпо оптической плотности растворапри длине волны 280 и 260 нм).Десорбцию проводят ступенчатымградиентом рН тремя 0,1 М фосфатными буферами: с рН 6,2; 6,7; 72.Скорость десорбции 44 мп/ч, Сначалапропускают 50 мл буфера с рН 6,2,затем 50 мп с рН 6,7 и наконец75 мл с рН 7,2. На выходе из колонки собирают фракции по 15 мп, в которых определяют рН, концентрацию белка (спектрофотометрическим методоми по методу Лоури) и малатдегидрогеназную активность (спектрофотомет-.рическим методом). фракции с удельной активностью выше чем 1000 ед/мгбелка объединяют, их объем 60 мл. ЗО 35 40 45 50 55 Общий белок 1,22 мг, общая активность 2908 едудельная активность2384 ед/мг белка. 3 1165402(рН 7,4) до концентрации 18 мг/мпи центрифугируют в градиенте плотности сахарозы (0,7:1,2:1,5 М) при60000 8 в течение 2 ч. Осадок представляет собой митохондриальнуюфракцию, очищенную от миелина и синаптосом. Общий белок 705 мг, общая активность 8 460 ед, удельнаяактивность 12 ед/мг белка. Очищенные митохондрии суспендируют в О0,01 М фосфатном буфере 7,4 и разрушают в гомогенизаторе типа Блендор при 13000 об,/мин. Гомогенатцентрифугируют при 150000в течение 60 мин для полного осаждениямитохондриальных мембран. Супернатант отделяют, его общий белок275 мг, общая активность 6,325 ед,удельная активность 23 ед/мгбелка, Доводят рН супернатантадо 6,0 0,1 Н соляной кислотой и центрифугируют при 10000 я в течение10 мин для осаждения выпавших восадок белков. Общий белок полученного супернатанта 118,6 мг, общаяактивность 3 795 ед, удельная активность 32 ед/нг белка.Супернатант пропускают через колонку, заполненную сорбентом "Биокарб" (внутренний диаметр колонки1,7 см, объем сорбента 3,9 см 5),со скоростью 88 мл/ч, По окончаниисорбции колонку промывают водой доисчезновения в промывных водах белка (контроль на белок осуществляютспектрометрическим методом).Десорбцию проводят ступенчатымградиентом рН тремя 0,1 М фосфатнымибуферами с РН 6,0; 6,5 и 7,0, скорость десорбции 44 мп/ч. Сначалапропускают 50 мл буфера с рН 6,0,затем 50 мл с рН 6,5 и наконец90 мл с рН 7,0. На выходе из колонки отбирают фракции элюата по 15 мл,в которых определяют рН, концентрацию белка (спектрофотометрическимметодом и по методу Лоури) и активность малатдегидрогеназы (спектрофотометриыеским методом), Фракциис удельной активностью 1000 ед/мгбелка и выше объединяют, Общий белок 1,22 мг, общая активность3080 ед, удельная активность2524 ед/мг белка.П р и м е р 3. Митохондрии изголовного мозга быка получают пометоду Фоиье и Шомодьи. Общий белок 4980 мг, общая активность1 б 5402 Составитель Э,ЦыганковТехред Ж, Кастелевич Редактор О.Юрковецкая Корректор В,Гирняк Заказ 4258/8 Тираж 722 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Иосква, Ж, Раушская наб д .4/Подписное Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4 Активность малатдегидрогеназы определяют спектроотометрическим методом по изменению концентрации НАДН в 1 см кювете при длине волны 340 нм. Исследована реакция окисления НАДН при рН среды 7,4, Эа единицу активности принято количество Фермента, необходимое для окисления 10 моль НАДН в 1 мин.Полученный препарат не содержит посторонних дегидрогеназных активностей (глютаматдегидрогеназной, лактатдегидрогеназной), Проведенный электроФоретический анализ пребпарата на гомогенность раствора показывает наличие в растворе двухбелков, один из которых идентиФицирован как малатдегидрогеназа.Продолжительность опыта с моментаполучениямозпа до получения Фермента 3-4 дня, собственно на очисткуФермента необходимо 9- ч,Таким образом, предлагаемый споО соб высоко надежен, прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, позволяет получать Фермент с удельной активностью2400-2550 ед/мг белка,