Способ выделения сфингомиелина

СОЮЗ СОВЕТСНИХЩИНИРЮЕШИПРЕСПУБЛИН 09 01) 4(51) СО Е 910 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ гь 4,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЮ Н АВТОРСНОМУ СВИДИВЪСТВУ(71) Дальневосточный государственный университет, Институт биологииморя Дальневосточного научного центраАН СССР и Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной биохимии Научно-производственного объединения "Биохимреактив"(56) 1. Бергельсон Л.Д. и др. Препаративная биохимия липидов. М.,"Наука",:1981, с. 259.2. Бюее 1 еу С.С. РцгИ 1 сагхоп апдрагЕа 1 сЬагасгеггафдор оГзрЬдпяошуе 11 п Егош Ьцшап р 1 азша.Л.ЕзрИ Кез 1963 В 4, р.402-406.3. Каг 1 зоп К,А. и др, "ТЬе зрЬпяо 1 др 1 о 1 сошрозгоп оХ Ъочдпе Кьап 1 усогйех, шейц 11 а апд рарПа, ВьосЬеш,ВдорЬуз.Асга, 1973, ЗД 6, У 3,р.317-335 (прототип).(54) (57) СПОСОБ ВЦПЕЛЕНИЯ СФИНГОМИЕЛИНА из сырья животного происхождения, включающий экстракцию липидов смесью хлороформ-метанол, щелочной гидролиз липидного экстракта и очистку сфингомнелина на колонке с силикагелем, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения технологии процесса и повышения выхода целе ного продукта, экстракцию липидов проводят смесью хлороформ-метанол при их объемном соотношении 1:1 с добавле нием 15-25 бб,Х воды от объема смеси, полученный липидный экстракт подвергают кислотному гидролизу разбавленной соляной кислотой, щелочномугидролизу разбавленным раствором щелочи с последующей очисткой сфингомиелина путем пропускания его через одну колонку с силикагелем, элюированием примесей смесью хлороформ- ЯЪФ метанол при нх объемном соотношении (4-5):(5-6) и сфингомиелина - смесью хлороформ-метанол при их объемном соотношении 2:8.Изобретение относится к химиифосфорорганических соединений,а именно к усовершенствованному способу выделения сфингомаелинар который находит широкое применение в 5изучении структуры и Функции мембран,в медицинских исследованиях, в частности, при изучении патологии головного мозга.Известен способ выделения сфингомнелииа из говяжьего мозга путемзкстракции из него липидов последовательно ацетоном, этанолом, петролейиым эФиром, двухкратным переосаждением в диэтиловом эфире с носледую щим выделением неочищенного сфиигожелина путем растворения Фракциисфингояипидов в смеси хлороформ-метанап 98:2)р очисткой иа колонкес окисью алюминия с последующим мяг кии щелочиьм гидролизом сфингомиелиновой фракции и ее нейтрализацией,растворением высушенного остатка всмеси петролейного эфира и метанола,осаждением ацетоном и .Очисткой на ко вовке с силикагелем. Из 500 гмозга получают 1 г .сфингомнелина, чтосоставпяет Ор 2 Х от исходного субстрата Я .30Однако этот. способ трудоемкий и длительныйр а выход сфингомиелина низкий.1Известен также способ выделения сфингамиелина, заключающийся в экст ракции липидов плазмы крови последовательно ацетоном, этанолом, смесью хлороформ-метаиол (2: 1)р разделении их на двух силикагелевых колонках, последующем мягком щелочном гидроли зе сфингомиелиновой фракции и дополнительной очистке яа колонке с силикагелем. Из 15 л крови (650 г плазмы) получают 94 О мг сфиигомиелина, что составляет Ор 14 Х от исходного ф 5 субстрата 21.Однако этот способ технологически сложен, так как требует длительной экстракции кипящими растворителями (24 ч ацетоном и 36-48 этанолом), 50 использования двух колонок с силикагелем для получения неочищенного сфингомиелина из,комбиниррванного этанольно-ацетонового экстракта и из хлороформ-метанольного экстракта 55 и дополнительной очистки грязного сфингомиелина на колонке с силикагелем. Выход сфингомиелина низкий. Наиболее близким к,изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ выделения сфингомиелина, заключающийся в четырехкратной экстракции липидов из говяжьих почек смесью хлороФорм-метанол (2: 1), проведении мягкого щелочного гидролиза их, нейтрализации, последующем отделении жирных кислот и холестерина от ли" пидов, устойчивых к щелочному гидролизу, колоночной хроматографией на силикагеле, колоночной хроматографии фракции сфинголипндов на ДЭАЭ-целлюлозе с последующим разделением нейтральной и кислой ефинголипидных фракций колоночной хроматографией на силикагеле. Выход сфинго- миелина 96 р 57 от исходного содержания сфингомиелина в субстрате 3 .Однако известный способ характеризуется большой длительностью, сложностью технологии, так как требуется двухкратная очистка прбдуктов на колонке с силнкагелем и с ДЕАЕ-целлюлозной, а также недостаточно высоким выходом целевого продукта.Целью изобретения является упрощение технологии процесса и повышение выхода целевого продукта.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения сфингомиелина из сырья животного проис хождения,экстракцию липидов проводят смесью хлороформ-метанол при их объемном соотношении 1: 1 с добавлением 15-25 об,7 воды от объема смеси, полученный липидный экстракт подвергают кислотному гидролизу разбавленной соляной кислотой, щелочному гидролизу разбавленным раствором щелочи с последующей очисткой сфингомиелина путем пропускания его через одну колонку с силикагелем, элюированием примесей смесью хлороформ-метанол при их объемном соотношении (4-5):. :(5-6) и сфингомиелина в .смесью хлороформ-метанол при их объемном соотношении 2:8.Контроль за составом липидного экстракта, составом фракций, элюируемых с колонки, и проверку чистоты полученного целевого продукта осуществляют с помощью микротонкослойной хроматографии на силикагеле и микроаналитических процедур,Для этой цели используют одно- и двумерную хроматографию; 1 - сис3275 3 113тема хлороформ-метанол-аммиак 65: 25: 5на пластинке обнаружено одно пятно;2 - хлороформ-метанол-ный аммиак65;25:5 первое направление, хлороформ-ацетон-метанол - уксусная кислота (ледяная) - вода 30:40:10: 10:5второе направление.Двухмерная ТСХ показывает однопятно, обнаруживающее Р-положительную реакцию на молибдатный реактив, 1 Охолин-положительную реакцию на реактив Драгендорфа.Жирные кислоты: 16:0 ( 18,3),17:0 (1,2), 18:О (9, 7), 18: 1(0,4); 19;0.П р и м е р 1. Получение сфинго- Ю миелина из дочек свиньи.1, Получение экстракта. 270 г свежезамороженных свиных почек измельчают на мясорубке. Трижды экстрагируют смесью хлороформ-метаиол 1:1 при соотношении ткань-растворитель 1:5, гомогениэируют 3 мин, добавлюят ;203 воды и вновь гомогеннзируют 3 мин, фильтруют на воронке Бюхнера или центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Объединенные экст 35 ракты разделяют на делительной воронке. Водный слой отбрасывают.Хлороформ-метанольный слой упаривают под вакуумом на роторном испарителе при 50 С. Из 270 г свиныхпочек получают 6,48 г общих липидов, из них Фосфолипидов 86. В состав Фосфолипидов входят, 7.: сфингомиелин 19,7; фосфатидилхолин 27,4; Фосфатидилэтаноламин 22,4; фосфатидилсерин 9,2; фосфатидилинозит 8,3; дифосфатидилглицерин 9, 1; дифосфатидилинозит 1,8; лизофосфатидилэтаноламин 1,4; лизофосфатидилхолин 1,3.Добавка воды 15-253 не влияет на выход конечного продукта. Снижение до 137 приводит к отсутствию расслоения в системе, увеличение свыше 253 ведет к уменьшению выхода конеч-55 ного продукта.Получение экстракта. 270 г свеже- замороженных свинных почек обрабатывают по примеру 1,1, но для экстрак-,ции используют систему хлороформ-метанол 2:1. Выход общих липидов6,32 г, из них фосфолипидов 843.В составе фосфолипидов 159 Х сфингомиэлина. По сравнению с примером 1,1содержание.сфингомиэлина в экстрактена 237 меньше.270 г свежезамороженных свинныхпочек обрабатывают по примеру .1,1 нодля экстракции используют системухлороформ метанол 1:2 Выход общих,липидов 6,35 г, из них фосфолипйдов803. В составе фосфолипидов 17, 13сфингомиелина. По сравнению с примером 1,Ъсодержание сфингомиелинав экстракте на 187 меньше.2. Получение сфингомиелиновой фракции. К общему липидному экстрактудобавляют 1 н. НС 1 в метаноле(на 6,48 г общего липидного экстракта 9 мл 1 и, НС в метаноле) .и инкубируют 30-40 мин при 37-40 С,нейтрализуют 1 н. ИаОН в метаноле,добавляют 1 н. ЯаОН в метаноле,(на 6,48 г исходного липидного экстракта 80 мл 1 н. ИаОН в метаноле)и инкубируют 30-40 мин при 37-40 С.К гидролизату добавляют 2 объема хлороформа и 1/5 ч дистиллированнойводы. После разделения фаз верхнююводную Фазу отбрасывают, нижнюю хлороформную Фазу проверяют на нейтральную реакцию и упаривают досуха нароторком нспарителе. В случае необходимости отмывку водой повторяютдо получения нейтральной реакции.Выход Фракции 5,90 г. Фракция готова к нанесению на колонку.Выделение сфингомиелина. Для разделения 5,9 г липидов используют180 г неактивированного силикагелямарки Л 40/100. Отношение силикагеляк загружаемой Фракции липидов 30:1,Силикагель суспендируют в системехлороформ-метанол (5:5) и загружаютв колонку диаметром 4 см и высотойадсорбционного столба 28 см, т.е.отношение диаметра к высоте 1:7,объем колонки 300 мл. На верх кладутбумажный Фильтр. Фракцию липидовв 100 мл смеси хлороформ-метанол (5:5)вносят в колонку и начинают процессэлюирования.Для элюирования используют: 2, 1колоночных объемов (0,63 л) смесихлороформ-метанол 5:5, выиыва:от холе"стерни; 4,5 колоночных объемовРедактор Н.Джуган Тираж 354 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Заказ 9917/24 филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектна, 4 1;35 л) смеси хлороформ-метанол6элюируют иетиловце эфиры ююрных кислот и цереброзидц; 12 колоночных объемов (3,6 л) смеси хлороформ-метанол2:8 выиывают сфингоииелин выход про дукта 995 мв с чистотой 993 чтосоответствует 995 Х от исходного количества сфингомиелина в свиных почках и 0373 от исходного количествасубстрата. П р и и е р 2. Зкстракт получаютпо примеру 1. Выделение сфингомиелиновой фракции проводят по примеру 1.Выделение сфингомиелина. Подготовку колонки ведут по примеру 1. Дляэлюции используют 5 колоночных объемов (15 л) смеси хлороформ-метанол5:5, 5,5 колоночных объемов (165 л)смеси хлороформ-метанол А;6 12,5 20колоиочных объемов (3,75 л) смеси хлороформ-метанол 3:7 - вымывают сфинго-.ииелин. Выход сфингоииелина 9 ОО мг,чистота 933,П р и м е р 3. Экстракт получают; по примеру 1. Выделение сфингомиелииовой фракции проводят по примеру 1. Выделение сфингомиелина. Подгото 5= ку колонки ведут по примеру 1. Для злюирования используют 5,5 колоночных объемов ( 1,65 л) смеси хлороформретанол 5:5. 10 колоночнцх объемов (3,0 л) смеси хлороформ-метанол 3;7, 4,5 колоночнцх объемов (1,35 л) смеси хлороформ-метанол 2:8. Выход сфингомиелина 1 г, чистота 853, загрязнен цереброзидами.Использование предлагаемого способа получения сфингомиелина по сравнению с известным позволяет повысить выход целевого продукта до 995 Х а также быстро, просто и без больших потерь получить хроматографически чистый продукт за счет удаления плазмалогенов при мягком кислотном гидролизе и дальнейшего выделения сфингомиелина на единственной колонке с силикагелем путем злюирования примесей смесью хлороформ-метанол (4-5):(5-6) и сфингомиелина - смесью хлороформ-метанол (2:8). Сфинго" миелин, полученный по цредлагаемому способу, значительно дешевле (в 21 раз) чем по известному.