@ -оксиэтил-гепта(оксиэтилен)-морфолин в качестве криопротектора

ОЮЗ СОВЕТСКИХ ОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИК А ВТОРСНОМУ(57)фоли р-и;сн,сн,ора. в качестве криопро Особеннос с, 28-30,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГИЙ ОПИСАНИЕ ИЗ(7 1) Институт проблем криобиологиии криомедицины АН УССР и Украинскийордена Трудового Красного Знаменинаучно-исследовательский институтэкспериментальной ветеринарии(56) 1. Лебедев Н.Н. Смирнова М.М,О механизме кислотного катализареакции окиси этилена с аминами.Журнал общей химии, 1969, т. 39;с. 2732-2736.2. Белоконь В.С. и др,ти митотического режима культурыклеток СПЭВ после замораживания.Изобретение относится к химическому соединению, конкретно к Н-оксиэтилгепта(оксиэтилен)-морфолину формулы используемому в качестве криопротектора, и может найти применение при низкотемпературном консервировании ядросодержащих клеток, в частности клеточных культур, выделенных из различных органов животных.Наиболее близким по структуре к соединению форЮулы (1) является И-ок сиэтилморфолин формулы 1 О О М-СН 2 СН ОН2 20 который используют для изучения кинетики оксиэтилирования аминов И .Известен диметилсульфоксид (ДАССО), используемый в качестве криопротектора при низкотемнературном консер-25 вировании биологических объектов, в частности, культур клеток 21.Однако ДМСО наряду с защитными свойствами (предупреждающими или ослабляющими повреждающее действие ф замораживания и оттаивания на клеточ., ные культуры при их низкотемпературном консервировании) может оказывать токсическое действие на биологичес-. кие объекты. В случае проникновенияего внутрь клетки возникает осмотический градиент на границе клетка -околоклеточная среда, который припереносе клетки в изоосмотическиеусловия может оказаться причиной ги 40бели живых структур. Для предупреждения указанного повреждающего действияприходится удалять криопротектор изклеток перед переводом их в физиологическую осмотическую среду, Удаление криопротектора из клеток услож 45няет и удорожает весь процесс криоконсервирования.Таким образом, ДИСО требует отмывания клеток после размораживания,чтоусложняет процесс консервирования, поскольку при отмывании необходимо соблюдать строгую асептику, иделает его дорогостоящим (применениеспециальных сред, занятость дополнительного, персонала). Он не эконо-мичен, поскольку применяется в относительно высоких концентрациях(до 1 ОХ), формирование монослоя кле-. точных культур, "подвергавшихся замораживанию под его защитой, происходит только на 4-5 сут. Он неустойчив при хранении: разлагается с образованием серосодержащих продуктов, обладающихфрезким неприятным запахом (сро хранения до 1 мес.).Цель изобретения - упрощение и удешевление процесса криоконсервирования, а также повышение степени защиты биологических культур при низкотемпературном консервировании.Поставленная цель достигается тем, что в качестве криопротектора применяют соединение формулы ф .Соединение формулы (1) получают взаимодействием морфолина с окисью этилена при 90-100 С в атмосфереоазота и давлении 800-1000 кПа.П р и м е р. 85 г (1 моль) свежеперегнанного морфолина помещают в обогреваемый реактор. из нержавеющей стали, снабженный злектромешалкой,.термопарой и устройством для дискретной подачи окиси этилена и системой охлаждения, и нагревают до 60-80 С.В реакционную смесь медленно порциями по 5-10 мл подают 440 г (8 моль) окиси этилена, регулируя давление в пределах 800-1000 кПа. Реакцию проводят в атмосфере азота, не допуская повышения температурыовыше 90-100 С. Реакционную смесь после подачи всей окиси этилена выдерживают 1-1,5 ч при 70-75 С, периодически продувая реактор азотом. Очитку полученной темноокрашенной жидкости (420 г) производят путем многократной (3-5 раз) обработки разбавленного 3-4 раза водного раствора активированным углем марки А, катионообменной смолой Ку-8 с. Воду и невошедший в реакцию исходный морфолин от синтезированного соединения отделяют, отгоняя их в вакууме (0,45 кПа, 27-3 1 С). Выход соединения (Х) 380 г (903).Продукт синтеза подвергают дальнейшему вакуумному фракционированию, отделяя ниэкомолекулярные олигомеры 0,4-0,5 кПа, 100-150 С). Выход соединения формулы (1) 320 г (773).Строение полученного соединения подтверждается данными элементного анализа, определения молекулярноймассы и ИК-спектроскопии.Найдено,7: С 55,01; Н 9,72 Я 3,08.Вычислено, %: С 54,66; Н 9,33;Х 3,19.Молекулярная масса расчетная 436,экспериментальная 425.ИК-спектры сняты на спектрофотометре "Бре 1 огд" в кюветах СаГ,Толщина слоя 0,8 мм, растворительСС 7, остаточное содержание влаги вобразце не превышает 0,1%.10При сравнении ИК-спектров полученного соединения и исходного морфолинаоказалось, что наиболее сильные различия наблюдаются в области поглощениявалентных колебаний амино-и оксигрупп(3600-3200 см 1). Если в спектреисходного соединения поглощение с максимумом средней интенсивности появляетсяполоса поглощения при 3320 см, относящаяся к валентным колебаниям аминогруппы, то в спектре оксиэтилированно 20го производного вместо нее появляетсяширокая сложная полоса поглощенияпри.3400-3595 см , обусловленная ва"лентными колебаниями ассоциированныхгидроксильных .групп полиоксиэтилено 25вой цепи,Отсутствие полосы, обусловленнойколебаниями аминогруппы в ИК-спектреполученного соединения, свидетельствует об отсутствии в целевом продук 0те непрореагировавшего исходного соединения.Полосы поглощения валентных и деформационных колебаний СН-групп вобласти 3000-2800 и 1400-1200 см 35отражают характер поглощения колебаний полиоксиэтиленовой цепи.Исследование криопротекторныхсвойств, соединения формулы (1) проводят следующим образом. 40Суспензию клеток почки эмбриона свиньи версенизированную (СПЭВ) 242 пассажа и:криопротектор,. К-оксиэтилгепта(оксиэтилен)-морфолин охлажо 45 дают в холодильнике до 4 С, после чего к суспензии при осторожном перемешивании в соотношении 1: 1 добавляют раствор криопротектора, .приготовленный на среде 199 с рН 7,4. Концентрация клеток (конечная) в50 суспензии 8 млн в 1 мл.Клетки выращивают в монослое ф на среде 199 с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и по 100 ед. пенициллина натриевой соли и стрептомицина хлоркальциевого комплекса на 1 мл питательной среды. Выбор оптимальной концентрации криопротектора и режима охлаждения клеток осуществляют в условиях многофакторного эксперимента при разных концентрациях криопротектора от 1,5 до 15% (конечная концентрация) и скоростях охлаждения. Наилучшие результаты получают при использовании криопротектора в 4,5-5,57-ной концентрации. При более низких и при более высоких (15%) концентрациях формирование монослоя значительно (в 2-3 раза) запаздывает по сравнению с контролем (нативный материал). При этом монослой выполняют отдельными островками, в ряде случаев сливающимися, его рисунок сглажен. Требуется проводить замену питательной среды (1-3 раза) или пересев клеток.Таким образом, отклонение концентрации криопротектора от оптимума приводит к тому, что время формирования моноелоя в 2-3 раза превышает время его выполнения при оптимальной концентрации.Суспензию клеток, смешанную со криолротектором, инкубируют при 4 С в течение 15 мин,. затем разливают в стеклянные ампулы по 2 мл, которые после запаивания помещают в контейнеры. Весь период эквилибрации клеток в среде криопротектора составляет 40 мин.Замораживание суспензии ведут по двухэтапной программе: со скоростью 1 С мин до -10, затем 100/мин до -196 С. Оттаивание проводят в вооодяной бане при 41 С,После оттаивания жизнеспособностьклеток оценивают по результатам прижизненной окраски трипановым синим (867).По морфологическим признакам клетки СПЭВ сохраняют в монослое эпителио. подобную форму, имеют вид неправильного четырехугольника. Цитоплазма клеток гомогенная, немного мелкозернистая. Ядра клеток округлой формы, реже овальной с 2-5 ядрьппками.Митотическая активность размороженных клеток не отличается от клеток, не подвергшихся . замораживанию(контроль) В первые сутки ростапосле размораживания в культуральнойсреде на матрасах митотическаяактивность составляет 33,3+ 1,57,на вторые сутки 39,0+6,17. и на третьи1089090 3 а43,01,5 Х. Монослой деконсервирован- дования криопротекторных свойств соеных и контрольных клеток формируется дннения формулы (1) представлены йа третьи сутки роста. Результаты иссле-в таблице,Сравнение криоэащитных свойств соединения формулы .(1) и ДМСОКриопротекторы Показатели Соединение формулы (1) ДМСО Конечная концентрациякриопротектора, Ж 10 4,5-5,5 Отмывание размороженных клеток с двукратнымцентрифугированием Не требуется Требуется8,6 62 Жизнеспособность, 7. Рост клеток в моно- слое,. сут 2 г 1 мес. Срок хранения в результате чего исключает удалениеего из клеток путем многократного отмывания, не снижает пролиферативную активность деконсервированных клеток, что значительно повышает производительностьтруда. Составитель Н.КапитановаРедактор Л.Пчелинская Техред М,Тепер Корректор С.Шекмар Заказ 2863/21 Тираж 410 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 Соединение формулы (1) в качестве криопротектора обеспечивает криозащиту при концентрации 4,5-5,53, что в 2 раза меньше необходимой для этих целей концентрации ДМСО. Формирование монослоя клеток культуры СПЭВ после консервирования с соединением формулы (1) происходит в течение 3 сут (аналогичио контролю),что уменьшает расход питательных сред. Соеди нение формулы (1) в качестве криопротектора не требует отмывания, что упрощает и удешевляет процесс консервирования, и устойчиво при хррнении (до 2 лет),Таким образом, И-оксиэтилгепта (оксиэтилен)-морфолин может эффективно использоваться в качестве криопротектора при замораживании клеточных культур, Предлагаемый криопротектор экономичен, поскольку применяется в относительно низкой концентрации, не обладает токсичностью для клеток,