Способ определения чувствительности лимфоцитов к левамизолу

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 9) (11) 3900ычкова,гй Г,П,Кран о Красного .им; акад,О Фет а 11ог 1 п гесопт - Ь се 11 ц 1 аг- 1976, ч, 7,Ю ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Киевский ордена ТрудовоЗнамени медицинский институтА. А, Богомольца(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ,ДИМФОЦИТОВ К ЛЕВАМИЗОЛУ,включающий двухэтапное инкубирование лим. фоцитов, обработанных певамиэолом с эритроцитами барана, центрифугирование и подсчет , Е-розеткообразующих клеток, о т л и ч аю щ и и с ятем, что, с целъю повышения чувствительности способа, центрифутнрование осуществляют после первого этапа инкубации лимфоцитов, обработанных левамизолом с эритроцитами барана, причем левамнзол берут в концентрации 0,01 мкг/мл среды, содержа-щей 1 ф 10 лимфоцнтов.Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии.Известен способ определения чувствитель.ности лимфоцитов к иммуномодуляторам (ти.мозину), включающий двухэтапное инкубиро.ванне лимфоцитов, обработанных иммуномодулятором с эритроцитами барана, центрифуги.рование. и подсчет Е-роэеткообразующих кле.ток 11.Однако известный способ недостаточно чув Оствителен,Целью изобретения является повышение чувствительности способа.Указанная цель достигается тем, что приосуществлении способа, включающего двухэтапное инкубирование лимфоцитов, обработанных левомизолом с эритроцитами барана,центрифугирование и подсчет Е-розеткообразуюших клеток, центрифугирование осуществляют после первого этапа инкубацни лимфоци. 20тов, обработанных левамизолом с эритроцитами барана, причем левамизол берут в концентрации 0,01 мкг/мл среды, содержащей1 10 лимфоцитов,Способ осуществляют следующим образом. 25Берут 0,1 - 0,2 мл крови из пальца, выделяют 110 лимфоцитов для двух проб.Лимфоциты одной из проб обрабатываютиммуномодулятором (например, 0,01 мкглевамизола в 0,1 мл среды 199) и инкуби-.руют один час при 37 С.Постановку реакции Е-розеткообразованияпроводят путем пятиминутного центрифугирования смеси суспензии лимфоцнтов с 0,4%-нойвзвесью эритроцитов барана (соотношение351;90) и двухэтапной инкубацией: 30 мин втермостате при 37 С и 18 - 20 ч в холодильникепри +10 С.Стимулирующий эффект иммуномодулято.ра (например, левамизола) определяют поразности процентного содержания Е-розеткообразующих клеток, стимулированных иммуномодулятором (например, левамизолом), испонтанных.П р и м е р.451. Выделение лимфоцитов.Кровь берут из пальца утром в одно итоже время в количестве 0,1 - 0,2 мл в силн.конированную пробирку, содержащую 0,1 млгепарина (25 ед, гепарина в 1 мл физиологи 50. ческого раствора), Взятую кровь разводятсредой 199 в 2 раза и наслаивают на 0,5 -1 мл смеси фиколуротраст (фикол-верогра.фин) - плотность раствора 1,077 г/мл, Центрифугнруют 30 мин при 400 ц в центрифуге с угловым ротором. Снимают белое кольцо (выделенная взвесь лнмфоцитов) с интерфазной поверхности в чистую пробирку, отмы.вают средой 199 трн раза в течение 1 О мин при 200 о, затем проверяют жизнеспособность выделенных лимфоцитов ло суправитальной окраске с трипановым синим и производят подсчет лимфоцитов в 1 мл.2. Обработка. лимфоцитов левамизолом, К 0,1 - 0,2 мл взвеси лимфоцитов прибав.ляют 0,01 мкг левамизола в 0,1 мл среды 199, инкубируют 1 ч при 37 С в термостате, центрифугируют 5 мин при 200 ц и с осадком ставят реакцию Е-розеткообразования,3, Постановка реакции Е-розеткообразования.Реакцию ставят параллельно с двумя про.бами лимфоцитов: чистой взвесью и с обработанными иммуномодулятором (например, левамнзолом), К 0,1 мл суспензии лимфоци.тов прибавляют 0,1 мл среды 199 н 0,1 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов барана (соотношение 1:90), Смесь центрифугируют в течение 5 мин при 200 ц, выдерживают в тер.мостате при 37 С 30 мин и оставляют на ночь (на 18-20 ч) при -10 С.На следующий день осадок осторожно ре. суспендируют и производят подсчет в камере Горяева 200 лимфоцитов, вычисляют процент клеток, образовавших розетки не менее, чем с четырьмя эритроцитами барана.4. Иммуностимулируюший эффект левамиэола оценивают по разности процентного содержания розеткообразующих клеток в пробах с иммуномодулятором и беэ него.Данные исследования чувствительности лим. фоцитов (э чего) к синтетическому (левами- золу) и естественному (тимозину) иммуно. модуляторам представлены в табл. 1. Установлено, что наиболее оптимальной концентраци. ей яевамизола при иСследовании чувствительности к ним лимфоцитов(и чтго) является 0,01 мкг/мл (0,005 - 0,05 мкг/мл) тимозина - 100 мкг/мл согласно предлагаемому способу (табл. 1). Показана более высокая достовер ность различий в числе Е.роэеткообразуюших клеток дс и после обработки иммуномодулятором при использовании предлагаемого спосо. ба, Количество больших розеток (т.е, присоединивших 9 и более эритроцитов) достоверно выше при использовании предлагаемого способа, что позволяет повысить чувствительность метода и точность подсчета результатов,1064952 3 4Таблица 1Эффективность влияния различных доз левамизолаи тимозина на количествоЕ-розеткообразующих клеток у детей с частыми распираторными заболеваниямисогласно известному и предлагаемому способам Среда 199 (контроль) 98 2,001 ,001 н и е, Р - достоверность различий по сравнению с контролем, Р - достоверность различий по сравнению с ранее известным спо Прн1064952инкубация, центрифутирование, инкубация;при такой последовательности действий 5образуется меньше розеток, особенно больших,но предлагаемому; . Предлагаемый способ (Т = .10 С) 10 42 27 54 15 44 60 18 55,3 19 48 47 Составитель Г. КрюкОваТехред С,Мигунова Корректор Л. Патаи Редактор С. Тимохина Подписное Тираж 689 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и. открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д, 4/5Заказ 10918/4 Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Изменение последовательности совершаемыхдействий по известному способу; Известный способ (Т=.4 ОС) Температура -10 С является оптимальнойдля процесса розеткообразования, так какпри ней образуется максимальное количествоЕ - РОК, особенно больших,Преимущество использования 0,4%-ной взвеси эритроцнтов барана:согласно известному способу50 10 (50010 )1: 5; центрифугирование, инкубация; при такойпоследовательности действий образуетсязначительно большее количество розеток,особенно больших.Данные, подтверждающие оптимальностьтемпературного режима согласно предлагаемо.му способу, представлены в табл, 2.Таблица 2согласно предлагаемому способу90 ф 10 (900 10)1: 90.Соотношение 1:90 обеспечивает оптимальный эффект роэеткообразования.Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность способа в 2-3 раза, а кроме того, позволяет сэкономить в 10 раз количество дорогостоящих реактивов и иммуномодулятора.