Способ определения цитотоксического эффекта лимфоцитов крови

(19) 01) СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 3(59 А 61 В 10 1Я ЕТЕ ИС ТВ К АВТОРСКОМ 4 нкоБорзвадарст Волго й про венныйградский тивочумВ.И.ки. Новикова диагност высоыхконт-,Р Св для эае де цкина Э эффект ельност ораторно 547.ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОбРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙг(71) Волгоградский госумедицинский институт инаучна"исследовательскиный институт(56) 1. Новиков Ю.К. иКлеточные методы иммуноМинск, 1979, с. 92-105.2. Морозова В.Л., ЦаМодель цитотоксическоговыявления гиперчувствитмедленного типа. - "Лабло", 1980, Ю 9, с. 54354) 57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИпутем добавления лимфоцитов к клеткам-мишеням с носледуюшим определением цитотоксического действия .поиндексу лизиса клеток-мишеней,о тл и ч а ю ц и й с я тем, что, с целью упрошения и повышения чувствительности способа, в качестве клеток-мишеней используют аутоэритроциты больного, причем учет реакции осуществляют в, капиллярах, а индекслизиса определяют по отношениюты столбиков сенсибилизированнэритроцитов к высоте столбиковрольных эритроцитов.йзобретение относится к медицине,а именно к иммунологии, и можетбыть использовано в различных областях клиническои и экспериментальноймедицины для диагностики инфекционной, лекарственной и других форм ал 5лергии.Пзвестен способ определения цитотоксического эффекта лимфоцитовкрови для выявления. состояния иммунного ответа организма путем взаимодействия Т-лимфоцитов с клеткамимишенями. В качестве последних применяют монослой опухолевых клетокфибробласты, эритроциты цыплят илиголубей, Для учета повреждений клеток-мишеней используют подсчет клеток.в гемоцитометре 1 3Однако данный способ сложен в исполнении, поскольку требует специальной подготовки клеток-мишеней и 2 Обольшого количества лимфоцитов.Наиболее близок к предлагаемомуспособ определения цитотоксическогоэффекта лимфоцитов крови путем добавления лимфоцитов к клеткам-мишеням с последующим определением цитотоксического действия по индексулизиса клеток-мишеней. Причем в качестве клеток-мишеней используютФэритроциты барана, нагруженные антигеном, а учет реакции осуществляют на фотоэлектрокалориметре и расчет индекса лизиса ведут по формулеа-б, где а и Е - оптические плотнос"3ти проб с сенсибилизированными антигенами-эритроцитами и контрольнымиэритроцитами с 2 ХОднако известный способ недостаточно чувствителен, поскольку диапазон измерения степени лизиса эритроцитов на фотоэлектрокалориметре ограничен за счет оптических свойствкювет и прибора. В 10 случаев можетдавать неспецифические реакции. Кроме того, он сложен в исполнении, так 45как эритроциты барана требуют специальной обработки и специального консерванта.Цель изобретения - упрощение и повышение чувствительности способа.,что согласно способу определения цитотоксического эффекта лимфоцитов.крови путем добавления лимфоцитов кклеткам-мишеням с последующим определением цитотоксического действия по 55индексу лизиса клеток-мишеней в качестве клеток-мишеней используютаутоэритроциты,больного, причем учетреакции осуществляют в капиллярах,а индекс лизиса определяют по отно- бошению высоты столбиков сенсибилизированных эритроцитов к высоте стол-.биков контрольных эритроцитов,Способ осуществляют следующим об.разом. 65 Получают 5-10 мл крови больного, отстаивают ее 30-40 мин при 37 ОС, отделяют верхний слой плазмы вместе с лейкоцитами, отмывают центрифугированием лейкоциты от плазмы, центрифугируют оставшуюся после отделения лейкоцитов кровь для получения осадка эритроцитов, отмывают их от следов плазмы, приготавливают 10-ную взвесь эритроцитов соединяют их с исследуемым антигеном, инкубируют 1 ч при 37 ОС, отмывают эритроциты центрифугированием от несвязавшегося антигена, соединяют взвесь сенсибилизированных эритроцитов с лейкоцитами и инкубируют 18-24 ч при 37 С.Учет степени лизиса эритроцитов осуществляют путем заполнения взвесью капилляров, запаивания их с одного конца, центрифугирования для получения осадков эритроцитов, измерения их высоты в миллиметрах и вычисления индекса лизиса эритроцитов по ФормуАле в , где А и Б - средняя высота столбиков сенсибилизированных и контрольных эритроцитов соответственно.Следует отметить, что реакцию эритроцитов с лейкоцитами ставят в соотношении 8/1-10/1 соответственно и осуществляют в среде с 10-20 аутосыворотки. Выяснена также способность аутоэритроцитов адсорбировать на себя антигены при инкубации 1 п м 1 Сго. Указанное выше соотношение является оптимальным для учета степени лизиса эритроцитов в капиллярах и получения столбиков эритроцитов высотой 0,5-3,0 мм, При других соотношениях эритроцитов и лейкоцитов столбик эритроцитов или совсем отсутствует, или получается столь незначительным, что его невозможно измерить в капиллярах. Кроме того, выявлена возможность использования аутосыворотки (10-20) в инкубационной среде взамен сыворотки крупного рогатого скота. Укаэанный процент сы" воротки в среде является существенным моментом, так как при большей ее концентрации проявляется действие антител на ход реакции.Способ испытан на модели туберкулезной инфекции..Из вены больного туберкулезом берут 5-10 мл крови с гепарином 25 ед/мл, отстаивают 30-40 мин при 37 ОС, отделяют верхний слой плазмы с лейкоцитами, центрифугируют при 1000 аб/мин 10 мин, плазму отделяют центрифугированием и используют в дальнейшем для приготовления среды 199 с 20 аутосыворотки. При наличии примеси эритроцитов в осадке лейкоцитов их лизируют следующим образом: к осадку клеток добавляют 5 мл 0,35-ной ИаС 1, осторожно пере1057017 при 1000 об/мин. К осадкам эритроцитов добавляют по 0,2 мл среды 199 с20 аутосыворотки н затем по 0,2 млвзвеси лейкоцитов. Пробирки встряхивают и инкубируют 18-24 ч прн 370 С,Учет степени лизиса эритроцитов дро"водят следующим образом из каждойпробирки набирают микропипеткой по10 мкл клеточной смеси в стеклянныекапилляры длиной 40 мм и внутреннимдиаметром О,7-0,9 мм, Диаметр капилляров предварительно стаидартиэируютдля данного опыта с помощью иглы дляпбдкожных инъекций, Один .конец капилляра эапаивают пластилином, центрифугируют,при 1600 об/мин 5 мин,монтируют их по 5 штук на предметном стекле лейкопластырем и затемизмеряют в миллиметрах высоту столбика эритэоцитов с помощью окулярнойлупы 10 . Степень цитотоксическогоэффекта лейкоцитов по отношению ксенсибилизированным зритроцитам ольного определяют по выаеприведеннойФормуле.В табл.1 приведены результатыопределения сенсибилизации к туберкулину с помощью Ммтотоксической реакции по предлагаемому способу..Таблица 1ЗуВысота столбиков эритроцитов, мм мешивают пипеткой 30 с, добавляют 0,6 мл 5-ного раствора МаС 1, центрифугируют при 1000 об/мин 10 мин, а затем отмывают осадок два раза средой 199. Отмытые лейкоциты суспендируют в 0,8 мл среды 199 с 20 ауто 5 сыворотки и хранят на холоде (при плюс 40 С) до использования в реакции. Для приготовления сенсибилизированных к антигену аутоэритроцитов кровь после отделения слоя лейкоцитов центрыфугируют при 1000 об/мин 10 мин, осадок эритроцитов отмывают два раза 0,9-ным раствором ХаС 1 по 5 мл. Готовят 10-ную взвесь эритроцитов,разливают по 0,2 мл в четыре полистироловые микропробирки (Эппендорфа или другого типа), добавляют антигены но 0,1 мя в первые три пробирки, а в четвертую - 0,9-ную ИаС 1 (контроль). В качестве антигенов используют ту беркулин (в ампулу с сухим антигеном добавляют 1 мл 0,9-ной ИаС 1 и затем разводят в соотношении 1:10 О;9-ным раствором 11 аС 1), кокцидиоидин и гистбплазмин (100 мкг/мп). Инкубируют 25 эритроциты с антигеном в течение 1 ч прн 37 фС, затем отмывают два раза 0,9-ной ИаС 1 путем центрифувирования Диагноз ндекс лизисаэритроцитов несенсмбилизированнк туберкулину сенсибилизированныхк туберкулину 2,5 1 Д2,6ф 1,3 2,6 2,6 1,2. 1,2 2,8 Активный 1,1туберкулезлегких 2,5 1,2 . Среднее 2,6 Среднее 1,2 Здоровыйдонор 2 ф 5237 1 03 2,2 2,3 2,2 2,4 2,2 2,2 2,6 2,4 Среднее 2,30 Среднее 2,37 Иэ таблицы видно, что в случае положительной цитотоксической реак" ции высота столбиков сенсибилиэиро" ванных аутоэритроцитов в капиллярах составляет в среднем 1,2 ьм,йесенсибилизированных - 2,6 а индекс лизиса эритроцитов - 0,52.Для проверки специфичности цито- токсической реакции применяют также тест-блокады цитотоксического действия лимфоцитов. Для этого выделенные из крови больного с активным туберкулезом лейкоциты инкубируют .сантигеном (к 10 6 клеток добавляют100 мкг туберкулина)в течение 18 чпри 37 С, отмывают от несвяэавшегося антигена центрифугированием,соединяют с аутоэритроцитами больного, Ю сенсибилизированными туберкулином,и определяют индекс иэ лизиса попредлагаемому способу.Втабл.2 приведены результаты определения блокады цитотоксического 5 действия лейкоцитов на клетки-мишени.1057017 Таблица 2 Лейкоцитыот больноготуберкулезом в активной Форме Высота столбиков эритроцитов, мм Индекс лизиса эритроцитов несенсибилиэированных ктуберкулину сенсибилиэированных к туберкулину1,0 2,4 0,9 0,43 Среднее 0,9 После инку" бации с туберкулином 1,9 2,0 1,8 2,1 2,2 2,2 2,0 2,2 1,9 2,1 0,87 Среднее 1,9 Среднее 2,18 Таблица 3 Диагноз Цитотоксический эффект лимфоцитов в способе Количество обследованных лиц предлагаемом известном Туберкулин Гистоплаэмин Туберкулин Кокцидиоидин Кокси- Гистодиои- плаздин мин 0 0 13 ф 14 2Активный туберку- лез 15 Неактивный туберкулез 0 0 Здоровыедоноры 0 0 20 П р и м е ч а н и е. Ф - число лиц с положительной реакцией. Из таблицы следует, что после инкубации лейкоцитов больного с туберкулином происходит блокада цитотоксического действия лимфоцитов на клетки-мишени,Таким образом, цитотоксическое действие лимфоцитов больных туберкулезом на аутоэритроциты, нагруженные туберкулином, имеет иммунологическую природу и обусловлено сенсибилизацией лимфоцитов к антигенам возбудителя туберкулеза.Предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет достичь большей чувствительности определенияу сенсибилиэации; в 10 случаев даетвозможность дополнительного обнаружения лиц с сенсибилизацией к туберкулину в группе с активным туберкулезом, в 15 - в группе больных с 351 неактивным туберкулезом и в 5 - сре.ди здоровых лиц. Это позволяет применять предлагаемый способ для оценки степени извлеченности больных отинфекции.В табл.3 приведены результатывыявления цитотоксического эффекталимфоцитов крови у больных туберкулезом по сравнению со здоровыми донорами..Заказ 9415/5 Тираж 713 ПодписноеВНИИБИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 филиал ППП фПатентф, г.ужгород, ул.Проектная, 4 Как следует из таблицы, предлагаемый способ позволяет выявить сенсибилизацию к туберкулину у двух больных с неактивным туберкулезом и у одного здорового донора. При клинико-рентгенологическом обследовании у них подтвердилось наличие активации туберкулезного процесса.Исследование цитотоксического эффекта лимфоцитов с гетерологичными аллергенами кокцидиоидином и гистоплазмином показало специфичность предла" гаемого способа (отсутствие реакции у всех обследованных), в то время как известный способ вызывал иногда появление неспецифических реакцийс указанными аллергенами, сенсибилизация к которым у больных и здоровыхлиц отсутствует. Таким образом, предлагаемый способ обладает большей чувствительностью определения сенсибилизации организма и позволяет точнее осуществлятьдиагностику, например туберкулеза. Кроме того,способ прост и достоверен, так как не требует специальных приборов, реагентов и позволяет одновременно проводить пять и более повторностей.