Способ получения амфолитаносителя для изоэлектрического фокусирования и изотахофореза

СОЮЗ СО 8 ЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии(56). 1, Ч 3.подгас 1 оч Я.И, еС а 1,ЯупЮ)еЫс апрЬо 1 уСея йоши Юе 1 яое 1 есг 1 с Госця 1 пд ой ргое 1 пя.Б 1 осЬещ. Б 1 орпуя. Нев.Сопап., 1973,ч, 54, р, 501.2. Авторское свитедельство СССРР 802310, кл. С 08 С 73/02 р 1982(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМФОЛИТАНОСИТЕЛЯ ДЛЯ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ФОКУСИРОВАНИЯ И ИЗОТАХОФОРЕЗА путеммодифицирования полиэтиленполиаминанепредельным соединением ивзаимодействия модифицированного полиЯО 10 221 А 1(59 С 08 6 73 02 С 07 С 7/00 этиленполиамина с акриловой кислотой., о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью увеличения эксплуатационных свойств амфолита-носителя,в качестве непредельного соединения используют соединения, содержа,щие активированную электроноакцепторными группами этиленовую связьобщей ФормулыФ, 2В. - И=61ФХгде Х - т.СИ ф -СООТГ, -СОВтф -СОНИН-ИО, 2-3- или 4-пиридил;й и Н - атом водорода, алкил илиарил;й и й- атом водорода, -СН или Х,и модифицирование осуществляют вводной среде при 20-70 С в течение 1-20 ч при молярном соотношениимодификатора и полиэтиленполиамина- Е 1-ОН=.С, Изобретение относится к биохимии, а именно: к способам разделения белковых веществ.Известны способы синтеза амфолитов-носителей для изоэлектрического Фокусирования, в частности способ получения амфолитов-носителейпутем взаимодействия акриловой кислоты с полиэтиленполиаминами (ПЭПА),например с триэтилентетрамином,тетраэтиленпентамином и пентаэтиленгексамином или их смесями (1 .Однако такие амфолиты-носителиобладают недостаточной разделяющейспособностью, малой буферной емкостью и малой проводимостью в нейтральной области рН.Наиболее близким к предлагаемому является способ получения амфолита-носителя из акриловой кислоты,и полиэтиленполиаминов, модифицированных И,И .-метилен-о 0 С -акриламидом (.23Однако И,М -метилен-бас -акриламид связывает амины и повышает мо;лекулярную массу амфолита-носителя,что усложняет его отделение от аналичируемых белков. Амфолиты-носители, полученные известным способом,обладают недостаточной буферной емкостью в нейтральной области рН,образуют недостаточно линейный гра"диент рН,Цель изобретения - улучшениеэксплуатационных свойств амфолитаносителя.Для достижения цели согласноспособу получения амфолита-носителя для изоэлектрического Фокусирования и изотахофореза путем модифицирования полиэтиленполиамина непредельным соединением и взаимодей,ствия модифицированного полиэтиленполиамина с акриловой кислотой, вкачестве непредельного соединенияиспользуют соединения, содержащиеактивированную электроноакцепторными группами этиленовую связь общейФормулы-ИО 1, 2-3- или 4-пиридил;В и й - атом водорода, алкил илиарил;В и В- атом водорода, -СН) или Х,и модифицирование осуществляют вводной среде при 20-70 С в течениео1-20 ч при молярном соотношениимодификатора и полиэтиленполиамина(1-3):1,В ходе модификации происходитприсоединение первичных и вторичныхаминогрупп полиэтиленполиаминовк активированной этиленовой связи 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 с образованием смеси веществ Формулы"М- ЕН, - ОН - М+2 ГЛ,Тгде У = Н или -СВ Н-СВ Хи = 1-6,Модификацию ПЭПА предпочтительнопроводить черед их взаимодействиемс акриловой кислотой, так как приэтом обеспечивается быстрая и полная реакция модификаторов, но возможна модификация в ходе действияи после действия акриловой кислоты.Разделяющая способность изоэлектрического Фокусирования определяется как разность наиболее близкихизоэлектрических точек белков, ещеразделяемых фокусированием. Согласно теории изоэлектрического фокусирования, два амфотерных электролита (амфолита) с различными изоэлектрическими точками не могутбыть разделены путем изозлектрического Фокусирования на отдельныезоны, Для этого необходим третийамфолит, имеющий изоэлектрическуюточку в интервале между изоэлектрическими точками разделяемых веществ. Например, для разделениябелков с близкими значениями изоэлектрических точек в амфолитеносителе должны быть вещества с промежуточными значениями изоэлектрических точек. Поэтому для достижения высокой разделяющей способности изоэлектрического фокусированиянеобходимо, чтобы в составе амфолитаносителя было возможно большее количество компонентов, распределенных во всем рабочем интервале рН.Это обеспечивает и прямолинейностьграциента рН.Изоэлектрическая точка амфотерного вещества определяется константами диссоциации его кислой и основ"ной групп. Изменение констант диссоциации обуславливает изменениеизоэлектрических точек амфотерныхэлектролитов. Сближение константдиссоциации кислотной и основнойгруппы увеличивает буферную емкостьи проводимость амфотерного электролита. Это создает возможность снижения концентрации амфолита-носителя, уменьшает выделяемое во время анализа тепло, стабилизируетградиенты рН.Предлагаемый способ полученияамфолитов-носителей улучшает ихсвойства, так как увеличивается чис.ло индивидуальных амфотерных сое-,динений в составе амфолита-носителя, Например, при взаимодействии1 моль триэтилентетрамина с 1 мольакриловой кислоты образуется двеамфотерные аминокислоты, содержащие в молекуле по одному-карбоксиэтильному остатку и. меньше пяти аминокислот, содержащих по дватаких остатка. Таким образом, вамфолите-носителе содержатся в за%метных количествах 7 амфотерныхсоединений. Если же на 1 моль триэтилентетрамина подействовать1 моль модификатора (например, акрилонитрила) и 1 моль акриловой кислоты, число образующихся амфотерных производных возрастаетдо 56, т.е. увеличивается восьмикратно. Если использовать не одинмодификатор, а несколько, числопроизводных еще многократно увеличится. Таким. образом, предлагаемая модификация дает возможностьувеличить на порядок и более число амфотерных компонентов амфолита-носителя, Это улучшает линейность градиента рН и разделяющуюспособность при изоэлектрическомфокусированииКроме того, при модификациисмещаются константы диссоциацииаминогрупп. Известно, что присоединение к аминам веществ, содержащих активированную этиленовую связь,изменяет константу диссоциацииданного амина, Так, присоединениевинилметилсульфона уменьшает кон;суанту диссоциации (рКц) на 2,82"3,13 ед;, присоединение акрилонитрила - на 2,21-2,50, 2-метилакрилонитрила - на 2,37-2,65,,) -дихлорэтилового эфира винил фосфиновой кислоты - на 1,70, винилметилкетона - на 0,40. Предлагаемая модификация понижает значениярК,( аминогрупп и сближает их с кон"стантами диссоциации кислотныхгрупп. Поэтому предлагаемый амфолит носитель приобретает большую бу ферную емкость и проводимость, посравнению с известными.Предлагаемый амфолит-носительготовят следующим образом.П р и м е р 1. В трехгорлой колбеемкостью 100 мл с мешалкой, капельной воронкой и приспособлением дляпродувки азотом помещают 9,0 г.(0,06 моль) триэтилентетрамина и20 мл деионизированной воды. Приперемешивании по каплям вводят1,59 г (0,03 моль) акрилонитрилаи 4,9 г (0,03 моль) метилового эфиравинилфосфоновой кислоты, Смесь перемешивают 2 ч при 70 С, затем охлаждают до комнатной температуры,добавляют по каплям 6,46 г(0,09 моль) свежеперегнанной акриловой кислоты и перемешивают 16 ч,при 70 С, Продукт реакции раздавиляют до 88 мл, трижды обрабатывают активированным углем (в ат/ 1062218мосфере азота) при 80-90 С и Фильтруют.Псчученный таким образом амфолит-носитель образует прямолинейный градиент рЧ в интервале3-9 при изоэлектрическом Фокусировании в градиенте плотности. Приизоэлектрическом Фокусировании втонком слое сефадекса амфолитноситель образует примерно прямо линейный градиент рН в интервале5,5-8,0. Аналогичные амфолиты-носители, изготовленные по известным методикам, дают нелинейные градиенты рН.15 П р и м е р 2. В аппаратуру,описанную в примере 1, помещают9,45 г (0,4 моль) смеси полиэтиленполиаминов (Фракция, кипящая при100-220 С/1 мм), 30 мл деионизированной воды, 3,3 г (0,025 моль)винидфенил сетона, 2,65 г (0,032 мольвинилметилсульфона, 2,15 г(0,025 моль) метилового эфира акриловой кислоты и 1,75 г (0,035 моль)винилметилкетона. Смесь перемешивают в течение 5 ч при комнатнойтемпературе, затем по каплям до,бавляют 1,2 г акриловой кислотыи перемешивают 20 ч при 70 С. Реакционную смесь разбавляют до 100 мли обрабаывают как описано в примере 1.Синтезированный таким путем амфолит-носитель образует прямолинейный градиент рН в интервале 3-8, 35 П р и м е р 3. В аппаратуру,описанную в примере 1, помещают11,3 г (0,07 моль) смеси полиэт;: -ленполиаминов (фракция, кипящая при100-200 С/1 мм) и 20 мл деионизи. - 40 рованной воды, Через капельную воронку вводят смесь 7,0 г (0,04 моль)акрилоилморфолина, 3,44 г (0,04 моль)кротонойитрила, 5,15 г (0,04 моль)винилсульфонамида и 6,48 г (0,09 моль) 45 акриловой кислоты. Смесь перемешивают при 50 С в течение 18 ч,оразбавляют деионизированной водойдо 110 мл и обрабатывают как описано в примере 1Синтезированный таким образомамфолит-носитель образует прямолинейный градиент рН в интервале 3-9.Снижение температуры дистилляции до 200 ОС исключает образованиеокрашенных смол, что улучшает качество амфолита-носителя. П р и м е р 4. (изоэлектрическоефокусирование белков).С помощью амфолита-носителя, по лученного по предлагаемому способу,проводят изоэлектрическое Фокусирование модельных белков в тонком слое сефадекса и в градиенте плотности. Определяют изоэлектрические 65 точки белков иэозлектрическим Фоку-.1062218 Изоэлектрическая точка, полученная с использованием предлагаемого амфолит-носителя Литературные данные Белок Среднеезначение Эксперимент 4,3 4,4 4,45 4,45 4,40 4,4 ферритин 4,66 4,6 4,65 4,7 4,7 4,7 Альбумин 7,2 7,3 7,3 7,35;7,4 7,31 7,3 Миоглобин Составитель В.ИкртычанРедактор Н,Егорова ТехредИ.Костик, Корректор А.Ильинт е тьшвевцеежйеевеетюе Эаказ 10154/26 Тираж 494 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП фПатент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 сированием в тонком слое сефадекса с использованием амАолнта-носителя,Изоэлектрические точки белков,полученный с использованием пред"лагаемого амфолита-носителя, хорошо совпадают с литературными данными.Разделяющую способность амфолитаносителя определяют изоэлектрическимФокусированием гемоглобина в градиенте плотности. Визуальное сравнение разделенных полос гемоглобинапоказало, что оно выше, чем в предлагаемом эксперименте с амфолитомносителем полученным по известному способу,изготовленного по примеру 2. бранныеприведены в таблице,Преимуществом предлагаемого способа является также упрощение процесса изготовления амфолитов-носителей за счет использования более легкокипящих фракций технической смеси полиэтиленполиаминов при сохранении достаточно хорошей линей" ности градиента рН. Снижение температуры перегонки упрощает этот процесс, кроме того, уменьшается возможность образования побочных окрашенных продуктов, что улучшает качество амфолита-носителя,