Способ получения эритроцитарного диагностикума

Юоез СоветскикСоциалистическихреспубиттк ЗО Я Х ВТОР СК полиительное к авт. саид.ву Кл 261 К 35/18) Заявлеио 25.06.75 (21)2153528/ аявки ЗЧЬ -присоединен есударстаеннмй кеететСената Мнннетраа СИРна делам нэобретеннйн еткрнтнй(23) Приоритет(43) Опубликовано 05,09,77)3 вллет Э 615.373 (088.8) ата опубликования описания 03,10.7(71) Заявите сесоюэный научно-исследовательский яшурный институт 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНО ДИАГНОСТИКУМА аторной может стабиль ов, троцитаридентих антита х антисы-го агенвысокой спе Ъвв ностикума.С целью повышения специфичности и стабильности диагностикума предложено в качестве свяэуюшего агента испольэовать 1- 3%-ный раствор хлористого или уксуснокиолого кадмия.Для сенсибилизации эритроцитов применяют яшурные, гипериммучные сыворотки морских свинок: яшурная сыворотка Ощ,е серия 31, титр в РСК 1:30; яшурная сыворотка А 2, серия Э 8, титр в РСК М 1;30, яшурИзобретение относится к лабордиагностике вирусных болезней ибыть использовано при полученииных эритроцитарных диагностикумИзвестен способ получения эриного диагностикума для проведениции пассивной гемагглютинации ификации и определении титра ящургенов, включающий формалинизациюцию эритроцитов, сенсибилизациюворотками в присутствии связующта 11Однако т акой способ не обеспечиваетцифичности и стабильности диа йая сыворотка Сат, серия 29, титр в РСК1:30.Контроль полученных эритроцитарных диагностикумов ставят с ящурными антигенами: б ящурный антиген 019, серия 38, титр вРСК 1:8, ящурный антиген Ай, серий 44,титр в РСК 1:8, яшурный антигвн Сотсерия 47, титр в РСК 1:6.При сенсибилнзации эритроцитов к смв 10 ои .формалинизированных таниэированныхэритроцитов барана с очищенными хлороформом, гипвриммунными сыворотками морских свинок добавляют 2%-ный раствор хлоритого хрома. Эритроциты свнсибилизируют 6 антисыворотками ОЕ, Аа и ССт . Контроль каждой серии полученных свнсибилизированных эритроцитов ставят с ящурнымиантигенами 09, Аа и СатПри постановке контроля полученных аритроцитарных диаг ностикумов в день сенсибилиэации отмечают перекрестные реакции части диагностикумов с аитигенами других типов вируса.Окончательный контроль полученных аритроцитарных диагностикумов ставят через З 3 дня после их получения.Диагностикум, полученный с использова- нием в качестве связующего хлористого хрома, дает перекрестные реакции с антигенами других типов, а диагностикумы, полученные с использованием в качестве связующе- Ь го солей кадмия: .хлористого кадмия и уксуснокислого кадмия, являются строго типоспецифичными. П р и м в р 1. У здорового барана, берут 10 кровь во флаконы, наполовину наполненныераствором Альсевера, мл: глюкоза 10,25, лимоннокислый натрий 4,0, лимонная кислота 0,278, хлористый натрий 2,1, бидистил, лированная вода до 500. флаконы выдержиовают при 4 С в течение 24 ч.К 100 мл смеси крови барана с раствором Альсевера быстро добавляют 40 мл 80%-ного раствора формалина (с содержанием 37% формальдегида) в физиологическом 20 растворе. Смесь выдерживают в водянойобане 1,8 ч при 37 С, помешивая через каж дыв 18 мин. Подученные формалинизированные эритроциты четырежды отмывают вс100 мл физиологического раствора выдержи 25овают 2 суток при 4 С, надосадочную жидкость сливают, а из осадка эритроцитов готовят 100%-ную суспензию на 0,18 М фосфатно-буферном растворе (рН 7,2) с добавлением 0,3% фенола. 30формалинизированные эритроциты могутосохраняться при 4 С до одного года. Затемформалинизированные эритроциты однократно отмывают и готовят 3%-ную суспензиюна физиологическом растворе. Полученнуюсуспензию смешивают с равным количеством раствора танина в физиологическом растворе (1:30000), Смесь выдерживают вводяной бане 15 мин, и эритроциты двукратно отмывают физиологическим раствором. 40 Эритроциты хранят в виде 3%-ной суспензии в 0,3%-ном растворе фенола на фосфатно-буферном растворе, После этого производят сенсибилиэацию эритроцитов ящурНыми антисыворотками, Для этого смешивают равйые количества 3%-ной суспенэии отмытых от консерванта танизированных эрияроцитов и обработанйой хлороформом ящурВой антисыворотки нужного штамма в разведении 1:20. Антисыворотка должна иметь йятр"в РСК 1:30 или выше.К смеси добавляют 2%-ный раствор хлорчстого кадмия Сс(С 2, 1:5. Смесь выдерживают при комнатной температуре ЗО мин и эритроциты дважды отмывают 0,15 М фосфатно-буферным раствором (рН 7,2). Из полученного осадка эритроаатов готовят 3%-ную суспензию на фосфат ю-буферном растворе с добавлением 1%ЮО 4нормальной сыворотки крови лошади и0,3% фенола.Реакцию ставят в микропанелях микротитратора Токачи с луночками, имеющими коническое дно. Исследуемые антигены разводятпоследовательно в объеме 0,05 мл и добавляют полученный эритроцитарный диагностикум в дозе 0,025 мп. Реакцию читают через 1,5 ч инкубации панелей при комнатной температуре по форме осадка эритроцитов. Оценку проводят в крестах в зависимости от степени агглютинации эритроцитов.П р и м е р 2. формалиниэацию и танизацию эритроцитов осуществляют так, какуказано в примере 1К 3% суспенэии танизированных эритроцитов добавляют 1%-ный раствор уксуснокислого кадмия, СИ (СНСОО)й, 1 ч раствора на 2,5 ч. суспензии. Смесь выдерживают при комнатной температуре 10 мин,К смеси добавляют обработанную .хлороформом антисыворотку в количестве, равномколичеству взятой суспензии эритроцитов,Смесь выдерживают при комнатной температуре 20 мин, Затем эритроциты дваждыотмывают 0,15 М и фосфатно-буфернымраствором (рН 7,2). Иэ полученного осадка эритроцитов готовят 3%-ную суспензиюна фосфатно-буферном растворе с добавлением 1% нормальной сыворотки крови лошади и 0,3% фенола.Эритроцйтарные диагностикумы, полученные предлагаемым способом, отличаются высокой специфичностью и стабильностью имогут быть успешно использованы для пое-,тановки реакции пассивной гемагглютинациипри идентификации и для определения титраящурных антигенов,формула изобретенияСпособ получения эритроцитарного диагностикума путем обработки эритроцитов формалином и таниином с последующей сенсибилиэацией их антисыворотками в присутствии связующего агента, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения специфичности и стабильности диагностикума, в качестве связующего агента используют 1-3%-ный раствор .хлористого или уксусно- кислого кадмия.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе.1. Методические указания по выделению и идентификации штаммов вируса ящура.