Способ получения полипептидов

(19) ИСАНИЕ СТ ДЕТ ВТОР СКОМУ,Гладыев,енинаинсти"РигдГ 1 хпе 1 Ьу 249,ОЛИПЕПТИельчейноЪоре хлоования,укт с моле 000 дальтон ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) 2-й Московский ордена Лгосударственный медицинскийтут им. Н.И.Пирогова(56) 1. Ноорег Я.А. е 1 а 1.са 11 оп апй ргорег 11 ея оГ Ъовоадп", Ащ. Н,З,Асаа, Яс 1125, 1975,,ЦОВ путем гомогенизации измткани железы тимуса в раствристого натрия, центрифугир нагревания, удаления осадка, обработки надосадочной жидкости ацетоном, растворения ацетонового осадкав фосфатном буфере, высаливания сернокислым аммонием с последующей ультрафильтрацией,.обессоливанием на сефадексе и лиобилизацией, о т л и -ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюполучения целевого продукта, обладаю-:.щего противоопухолевой активностью,гомогенат выдерживают в течение 12-.16 ч, после высаливания ультрафильтрацию осуществляют через мембрану сноминальным удержанием по глобулярным белкам 12,000-30,000 дальтон,.затем проводят гельхроматографию насефадексе при рН 6,8-8,2 и перед лиофилизацией выделяюткулярной массой 1,50Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности, аименно к технологии получения веществ иэ животного сырья.Известен способ получения полипептидов путем гомогениэации измельченной ткани железы тимуса в растворе хлористого натрия, центрифугирования, нагревания, удаления осадка,обработки надосадочной жидкости ацетоном, растворения ацетонового осадка в Фосфатном буфере, высаливаниясернокислым аммонием с последующейультрафильтрацией, обессоливаниемна сефадексе и лиойилизацией, Полученное вещество не подучило широкогопрактического применения ввиду недостаточной выраженности терапевтического эффекта 1 3.Отсутствие постоянного терапевтического эйфекта связано с малой биологической активностью полипептидови неоднородностью по йизико-химическим свойствам.Молекулярная масса данного вещества, определенная методом гельхроматографии, составляет.1,20017,000 дальтон, что указывает наприсутствие большого количества примесных соединений.Целью изобретения является получение полипептидов, обладающих противоопухолевой активностью.Эта цель достигается тем, чтоизмельченное сырье железы гомогенизируют в растворе хлористого натрия,выдерживают в течение 12-16 ч, после высаливания ультрафильтруют через мембрану с номинальным пределом удержания по глобулярным белкам 12,000-30,000 дальтон, гель-хроматографируют на сефадексе в буФере,рН 6)8-8,2 с ионной силой 0,1-.0,4 Мнатрий хлор или калий хлор и выделяют целевой продукт с молекулярноймассой 6,000-1,500 дальтон,П р и м е р. 500 г свежезамороженного тимуса телят (-20 С очищают от капсулы и измельчают спомощьюразмельчителя тканей РТпри8000,об/мин в .течение 3 мин, Гомогенизируют в 0,14 М растворе хлористого натрия в соотношении 1:3 и выдерживают в течение 16 ч при 4 С. Водонерастворимый материал удаляют центрифугированием при 20000в течение 2 ч. Полученный супернатант вобъеме около 1,5 л нагревают при80 С в течение 15 мин на водяной ба,не. Денатурированные термолабильные компоненты удаляют после охлаждения центрифугированием при 2000в течение 1 ч. Супернатант (объемоколб 1,35 л ) обрабатывают пятикратным объемом ацетонаохлажденным до-20 С. Выпавший осадок промываютацетоном, декантируют и сушат в вакууме. Сухой ацетоновнй осадок растворяют в 100 мл 10 мм натриййосфатногобуфера рН 7,0 при непрерывном перемешивании в течение 1 ч при комнатной температуре. Нерастворимую частьудаляют центрифугированием при16 000 в течение 40 мин. В получен,ном супернатанте определяют концентрацию белка по биуретовому методу,доводят концентрацию белка до 10 25 мг/мл, причем конечный объем смеси составляет 119 мл, К этому раствору добавляют 39,6 мл раствора сульфата аммония, насыщенного при 4 С ирН 7,0. Смесь перемешивают в течение 15 1 ч при 4 С, Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием при16000. Супернатант подкисляют уксусной (10-ной) кислотой до рН 4,7,Объем смеси составляет 170 мл. Ксмеси при непрерывном помешиваниидобавляют 24,82 г сульйата аммония,перемешивание продолжают в течение1 ч при 4 С. Осадок собирают центриФугированием при 16000, растворяют.в 80 мл 10 мМ Трис- НСЕ, рн 8,0 иповторно осаждают добавлением 80 млнасыщенного при 4 С раствора сульфата аммония. Осадок вновьсобираютцентрифугированием, растворяют в10 мМ Трис- НСР, рН 8,0. Полученныйраствор (объем - 140 мл, конц. белка 10 мг/мл )подвергают ультрафильтрованию через мембрану "Ре 11 оопРВЕМ (М 1111 роге)" на аппарате "Системамм" при 4 С под давлением З 5 азота 3,5-4 атм, Дополнительную промывку осуществляют 10 мМ Трис- НС 1,рН 8,0 (3 порции по 150 мл). Объеми концентрация белка для фильтратаи фракции, задержанной Фильтром, 40 составляет соответственно 510 мл,)0,7 мг/мл и 86 мл, 12 мг/мл, Фракции обессоливают и лиойилизируют.Минимальная активная доза препаратасоставляет 75 мкг на 3 10 лимфоци тов для фильтрата, а Фракция, задержанная фильтром, неактивна дажев дозе 800 мкг, Часть йракции Фильтрата - 30 мг - растворяют в 0,2 МКСР на 0,601 М Трис-НИ, рН 8,0.инаносят, на колонку 1 100 см с сефадексом 6-50, уравновешенную тем жебуйером, Материал собирают с молекулярной массой 6000-1500 дальтон,обессоливают, лиофилиэируют. МинИмальная активная доза препарата составляет 1-2 мкг на 3 млн. лимйоцитов.Общий выход целевого продуктасоставляет 110 мг/кг тимуса. Активность по тесту ингибирования спон 60 танного розеткообразования азатиоприном не более 1 мкг на 3 10 лимФоцитов,Полученные полипептиды имеют маКсимум поглощения в ультрафиолето 65 вом свете при 208 и 275 нм, содержат,997298 Редактор П,Горькова Техред М.Кузьма Корректор 1,Пилипенко Заказ 9191/1 Тираж 687 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Я, Раушская наб д. 4/5Филиал. ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 фракции с электрофрретической подвижностью в полиакриламидном гелепо отношению к бромфеноловому синему: 0,082+0,002; 0,169+0,004, 0,364+10004, 0,402+0,002,.0,452+0,004,0,515+0,005, 0,890+0,004, Кроме того, не обладают антигенностью и невызывают побочных явлений,Полипептиды вводили больным слимфогрануломатозом в дозе 50 мкг/межедневно в течение 10 дней, затемчерез день в той.же дозе. После окончания курса размер опухоли уменьшается в 2-2,5 раза.Полипептиды вводили также больнымв дозе 50 мкг/м. Определяли количество Т-РОК в периферической крови,Нормализация Т-иммунной системыЪ Т-РОК не менее 60) достигается на7 день после введения.Предложенный способ позволяет получить.полипептиды, обладающие высо кой чистотой и проявляющие противо- .опухолевое действие.