Способ получения иммобилизованного плазминогена

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскияСецкалистическняРеспублик р 1)979508(22) Заявлено 230780 (21) 2960037/28-13с присоединением заявки Нов(23) Приоритет -Опубликовано 071282. Бюллетень М 45Дата опубликования описания 0712.82 И 1 М, Нп.З12 М 11/06УС 12 й 1/80 Государственный комитет СССР ио делам изобретений и открытийС,А,Кудинов, И.М,Бабенко и С.П.Мацуй":г;,.;Ф 1 ъс1/. (Ордена Трудового Красного Знамени инстит химйним. А.В.Палладина(54 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ПЛАЗМИНОГЕНАИзобретение относится к технологии получения иммобнлнзованных препаратов и может быть использовано вферментной промышленности и медицине, а именно в медицине в терапевтических целях, поскольку целый рядзаболеваний человека обусловленспецифической ферментной недостаточностью,Иммобилизация биологически активных соединений, в частности Фермен-,тов, широко испЬльзуется для их модификацииТаким способом повышают температурную стабильность Ферментов,устойчивость к действию денатурирующих агентов, продлевают время действия ферментов,Плазминоген - профермент основного компонента противосвертывающей системы крови плазмина, основная физиологическая роль которого - лизнс образовавшихся фибриновых сгустков (тромбов ).Известны способы иммобилизации плазминогена с помощью ковалентного связывания с носителем. Например, способ иммобилизации плазминогена на активированной бромцианом сефарозе Г 13. Наиболее близким к предлагаемому является способ иммобилизации плазминогена на актнвированной бромцнаном сефарозе. Полученные по этому способу препараты иммобилизованного плаз инногена содержат 0,7 - 1,3 мг белкг на 1 г сухой сефароэы, а удельнаяактивность препарата после активации составляет 1,5-3,1 казусно.нтпческих единиц на 1 мг белка 121Недостатком укаэанных способов является то, что иммобилизацию плаэминогена осуществляют путем ковалентного связывания, в результате. чего - снижается Фибринолитическая активность и поэтому препараты не могут испЬльэоваться в медицинских целях.Цель изобретения - повышение удельной активности целевого продукта,Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилиэованного плазминогена с использованием в.качестве носителя активированной бромицианом сефарозы, в качестве носителя используют связанную с Фибриногеном активированную бромцианом сефароэу, а иммобилизацию проводят в 0,1 М Фосфате натрия рН 7,6 с последующим удалением не- специфически сорбированного плаэми979508 Удельная активность им- мобилизованного плаэминогена после активации стрептокиназой,ке/мг Содержаниеактивности исходного препарата растворимогоплазминогена,Количество плазминогена,иммобилиэированного на 1 мп Фибри- ноген-сефароэы 10 5586 5 5 5,6 2 3 2,3 1,5 15,4 22,4 12 0,8 30,0" В 1 и 2 опыте исходная активность 10 ке/мг; "ф в 3-6 опытах исходная активность. 6,5 ке/мг,ногена промывкой тем же буфером с добавлением 0,5 М хлористого натрия,При условиях аффинной иммобилизации происходит сорбционное связывание фермента с носителем на основе естественного биоспецифического срод ства, что позволяет получить препараты с регулируемой способностью активироваться в плаэмин, Аффинное связывание плазминогена, а после его активации и плазмина, с фибрино- )О геном реализуется не через активный . центр, а через лизин-связывающие )участки. Активный центр плазмина при соединении с фибриногеном остается свободным и способен взаимо- )5 действовать с белковыми субстрами, в частности с казеином.П р и м е р 1. Активацию сефарозы осуществляют по обычной методике. Бычий фибриноген подвергают диалиэу против 0,1 М фосфатного буфера при рН 7,8 на холоде в течение 24 ч против 10 л буфера. Затем к 16 мп активированной сефарозы добавляют 71 мл отдиализированного фибриногена, Реакция связывания протекает при 4 С под аргоном в течение 19 ч. Несвяэавшийся Фибриноген отмывают последовательно 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,8 2-3 л ), 0,1 М трис-фосфатным буфером, рН 8,6;1 М хлористым натрием, 0,025 Я Е-аминокапроновой кислотой ( 3 л ), 0,1 М трис-фосфатным буфером, рН 4,1; 1 М хлористым натрием и 0,025 М 8-аминокапроновой кислотой, рН 7,6 (2 л ), 0,1 М НРО 4 и 0,2 М глицерином (2 л ); 0,05 И трис-НЗРО 4, 0,1 М хлористым натрием 0,025 М 8-аминокапроновой кислоты рН 7,6 (,2 л/.Отмытую фибриноген-сефароэу хранят при 4 С с йаМОЗ, ЭфФективность 40 связывания - 0,150 г фибриногена на 1 г сефароэы (сухой ) или 40 мгна 1 мл серофаэы. 4 мл плазминогена в 0,1 М Фосфатном буфере, рН 7 б с концентрацией белка 1 мг/мл и удель-.45 ной активностью 10 ке/мг медленнопропускают через 1 мл (осевшей ) фибриноген-сефароэы, упакованной в капиллярную колонку. Неспецифическисорбированный плаэминоген удаляютпромыванием колонки этим же буферома затем буфером с добавлением 0,5 Мхлористого натрия до исчезновениябелка в промывных водах. На геле иммобилизуется 2 мг плаэминогена,удельная активность плаэминоген-фибриноген-сефарозы после активациистрептокиназой 10 ке/мг сорбировавшегося профермента. Через этот плазмино.ген-фибриноген-гель таким же способомпропущено 2 мп раствора плазминогена,содержащего 2 мг белка. После удалениянеспецифически сорбировавшегося плазминогена на геле иммобилиэовалось еще2 мг белка, удельная активность геля5,5 ке/мг,П р и м е р 2. Через колонку, заполненную 2 мп фибриноген-сефарозыпропущенокак описано в примере 1), 2 мл плаэминогена с концентрацией5 мг/мли удельной активностью6,5 ке/мг, Затем удаляют неспецифически связавшийся белок (как описанов примере 1), На фибриноген-сефароэеиммобилизовалось 3,8 мг белка на 1 млгеля. Удельная активность геля"5,6 ке/мг,Через полученную плазминоген-фибриноген-сефарозу тризиды пропускают по 2 мл раствора плаэминогена, содержащего 15 мг белка. После каждого пропускания гель отпивают от неспецифически связавшегося белка(пример 1)После 1,2 и 3-го пропускания плаэми- ногена содержание плаэминогена в препарате составляет соответственно 15,4; 22,4 и 30,0 мг белка,.а удель 7 ная активность снижается до соответственно 2,3 1,5 и 0,8 ке/мг, Результаты испытаний приведены в таблице.