Способ иммобилизации белковых молекул

Союз Советских Социалистических Республик(51)М. Кл.З с присоединением заявки Йо С 07 С 7/024 А 61 К 37/48 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(71) Заявитель Ленинградский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова(54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ Изобретение относится к области прикладной биохимии и может применяться для создания препаратов различных иммобилизованных ферментов, используемых в процессах ферментативного катализа.Известен способ иммобилизации белков на поверхности пористых силикатных носителей, заключающийся в том, что пористые силикатные носители обрабатывают 3-аминопропил-триэтоксисиланом, а образующиеся при этом на поверхности носителя алкиламины обрабатывают глутаровым альдегидом, в результате чего на поверхности носителя закрепляются альдегидные группы, способные ковалентно присоединять белковые молекулы Г 1 .Однако для присоединения молекул белка к носителю аминогруппы алкиламина необходимо дополнительно активировать глутаровым альдегидом,В результате взаимодействия глутарового альдегида с алифатическими аминами поверхности носителя на последней возникают молекулярные группировки, способные образовать в белках внутримолекулярные мостиковые связи, что приводит к существенному уменьшению конформационной подвижности белковых молекул, а следовательноги к уменьшению или полной потерекаталитической активности иммобилизованных ферментов, при иммобилиза ции различных ферментов на пористомстекле известным способом сохраняется только 5-50 первоначальноиактивности фермента,Таким образом, применение -амино пропил-триэтоксисилана и глутаровогоальдегида приводит к значительномуусложнению процесса иммобилизациибелков на поверхности силикатных носителей.15 Цель изобретения - упрощение способа получения им;обилизованных белков, а также улучшение их качества.Это достигается тем, что в известном способе в качестве активирующего 20 агента используют (3,3-диэтоксипро-пил) триэтоксисилан (ДЭПТЭС) в количестве, не превышающем трехкратныймолярный избыток по отношению к количеству гидроксильных групп, имею щихся на поверхности носителя. Причем, перед присоединением белковыхмолекул модифицированный носитель обрабатывают 1 н. соляной кислотой.Применение ДЭПТЭС позволяет в одно ступенчатой процедуре создать на поверхности носителя потенциальноактивные группы за счет наличия в этом агенте ацетальной группировки. Кроме того, ДЭПТЭС - вещество легкодоступное, устойчивое, и для присоединенияносителю не требует предварительных химических преобразований. Использование ДЭПТЭС позволяет легко менять плотность активных групп на поверхности носителя путем варьирования количества агента, вносимого в реакцию.Укаэанное количество ДЭПТЭС, вводимое в реакцию, определяется тем, что данное вещество склонно к образованию пОлимерных .структур, которые при их избытке могут закупорить поры 15 носителя.Обработка пористого силикатного носителя после модифицированной обработки его поверхности с помощью ДЭПТЭС 1 н. соляной кислотой необхо- до дима для окисления ацетальной группы, что приводит к возникновению собственно активных групп пропионового аль дегида, взаимодействующих в дальнейшем с аминогруппами белков.Результаты титрования альдегидных .групп на пористом стекле, обработанном (3,3-диэтоксипропил)-триэтоксисиланом, до и после его обработки 1 н. соляной кислотой показывают, что в выбранных условиях модификации носителя альдегидные группы на его поверхности возникают только после обработки модифицированного носителя 1 н, соляной кислотой. Этоозначает, что ацетальная группировка в процессе З 5 взаимодействия ДЭПТЭС с поверхностью носителя не вовлекается ни в какие химические превращения. Следовательно, на поверхности носителя образуются алифатические альдегиды точно из- иЩ вестного строения. Конечным продуктом является силикатный носитель, имеющий на поверхности ацетальные группы, которые в кислой среде 1 н. соляной кислоты переходят в пропионовый альдегид, способный взаимодействовать с аминогруппами белковых молекул с образованием шиффовых оснований. Присоединение бел- р ковых молекул к поверхности активированного носителя проводят выдерживанием носителя в растворе белка с последующей обработкой носителя боргидридом натрия для восстановления образовавшихся лобильных шиффовых оснований в устойчивый замещенный альдимин.П р и м е р 1. 40 г широкопористого стекла ,ШПС) со средним диаметром пор 2000 А, пористостью 0,69 см 1 Я /г, поверхностью 14 м /г и содержащем гидроксильные группы в количестве 100 моль/г помещают в круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой и обратным холодильником, 65 заливают 150 мл. концентрированной соляной кислоты и 15 мл 30% перекиси водорода, Колбу греют 1 ч при 100 С с интенсивным перемешиванием содержимого, Затем пористое стекло промывают на стеклянном пористом фильтре последовательно тремя литрами дистиллированной воды и 200 мл ацетона, Далее пористое стекло сушат над вакуумом при 150 С в течение 5 ч. Суюхое ШПС помещают в ампулу и заливают смесью, содержащей, мл: ( 3,3-диэтоксипропил ) триэтоксисилана, 3,5,НО 0,7; 2 н. НС 1 0,2 и абсолютного тетрагидрофурана 60. Ампулу запаивают и оставляют при 73 С на 12 ч. Затем ампулу вскрывают и сушат содержимое под вакуумом в течение 3 ч при 100-120 оС. Высушенное ШПС заливают 100 мл 1 н,соляной кислоты и выдерживают 2 ч при комнатной температуре при интенсивном перемешивании на роторной мешалке. Затем ШПС промывают последовательно 3 л дистиллированной воды и 150 мл этанола и сушат под вакуумом при 80-100 С, Приготовленное таким образом активированное ШПС по данным титрования солянокислым гидро- ксиламином содержит 80 мкмоль альдегидных групп на 1 г ШПС. 1 г активированного ШПС промывают на стеклянном фильтре 10 мл 0,1 М глицерофосФатного буфера (рН 7), Затем активированное ШПС заливают тем же буфером так, чтобы буфер только покрывал ШПС, и дезаэрируют под вакуумом. К подготовленному таким образом носителю добавляют 0,2 мл раствора фермента полинуклеотидфосфорилазы (К.Ф. 2,7.7,8 ) с концентрацией белка 1 мг/мл и удельной активностью 600 ед/мг, предварительно отдиализованного против 0,1 М глицерофосфатного буфера (рН 7 ). Реакционную смесь перемешивают 12 ч на роторной мешалке при 4 С. После завершения реакции жидкую фазу удаляют и добавляют 2 мл раствора боргидрида натрия 1 мг/мл) в глицерофосфатном буфере ( рН 7) . Через 1 ч перемешивания при 4 С ШПС с иммобилизованным ферментом промывают последовательно 10 мл глицерофосфатного буфера, содержащего 1 М . ИаС и 0,1 М трис-НС 1 буфером, рН 8,2. Во всех промывных растворах и в препарате иммобилизованного на пористом стекле фермента определяют ферментативную активность. За ферментативной реакцией следят по накоплению неорганического фосфата, выделяющегося при синтезе полиадениловой кислоты из аденозиндифосфорной кислоты. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое обеспечивает выделение 1 микромоль неорганического фосфата за 15 мин, Ферментатнвную активность во всех случаях определяли при 37 ОС в реакционной смеси, содержащей в 1 мл; трис-НС 1 100 мкм,681837 Формула изобретения Составитель П. Конкова Редактор Л. Письман Техред А,Шепанская Корректор Г, Назарова Заказ 9244/74 Тираж 495 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 аденозиндифосфорной кислоты 10 мкм, И 9 С 1 5 мкм, рН 8,2.В промывных водах ферментативной активности не обнаружено. Препарат ШПС с иммобилизованным ферментом содержит 100 ед. активности, или 80 от внесенной в реакцию. Фермент, иммобилизованный на пористом стекле, активированном (3,3-диэтоксипропил)- триэтоксисиланом сохраняет практически без уменьшения свою активность приохранении при 4 С в течение 3-х месяцев.П р и м е р 2. 2 г активированного ШПС, приготовленного, как описано в примере 1, промывают 0,1 М натрийацетатным буфером (рН 5) с концентрацией 13,2 мг/мл, заливают 10 мл раствора яичного альбумина в том же буфере, дезаэрируют и оставляют на роторной мешалке при 4 С на 12 ч. Жидкую фазу удаляют и заливают ШПС 10 мл раствора боргидрида натрия (1 мг/мл) в натрий ацетатном буфере и перемешивают еще 1 чЗатем пористое стекло промывают последовательно растворами; 10 мл натрий-ацетатного буфера рН 5, 10 мл того же буфера с 1 М МаС 1; 10 мл 0,01 н. НС 1 и 20 мл 0,1 М натрий-ацетатного буфера. В исходном растворе белка и в промывных растворах содержание белка определяют по поглощению .растворов при 280 нмР считая, что весовая экстинция яичного альбумина составляет О,бб ед. оптической плотности на 1 мг белка.Обнаружено, что жидкая фаза удаленная изреакционной смеси после инкубации ШПС с раствором белка, и первые два промывных. раствора содержат 102 мг яичного альбумина. Таким образом, к 1 г активированного с помощью ДЗПТЭС пористого стекла ксЕаяецтно присоединилось 15 мг яичного альбумина,Использование предлагаемого способа иммобилизации белков на поверхности силикатных носителей обеспечивает, по сравнению с существующим способом следующие преимущества: улучшается качество активированной поверхности носителя, несущей альдегидныегруппы, что выражается в сохранениисущественно большей активности им мобилизованных ферментов (80 в из -вестном способе),упрощение способа засчет исключения дополнительных операций для создания активных групп на поверхности носителя. Способ иммобилизации белковых мо 2 р лекул на поверхности пористых силикатных носителей путем активации поверхности последних производным триэтоксисилана с последующим присоединением белковых молекул, о т л иа ю щ и й с я тем, что, с целью,упрощения способа и улучшения качества целевого продукта, в качестве производного триэтоксисилана используют(3,3-диэтоксипропил) триэтоксисиланв количестве не превышающем трехкрат 30 ный молярный избыток пе отношению кколичеству,гидроксильных групп на поверхности носителя, причем перед присоединением белковых молекул носитель дополнительно обрабатывают 1 н.35 соляной кислотой.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Яеейа 11 Н. Н., Г 11 Ьег 1 а. М,ИесЬодь 1 п епгуво 1 оцу , 3 ч, р.59-72,974 (прототип),