Способ определения активности фосфофруктокиназы (к. ф. 2. 7. 1. 11) в сперме животных

О П И С А Н И Е 635424ИЗОБРЕТЕН И Я Союз Советских Сониалмстических Республик-в 51)М.Клб 01 Я 31/11 2 влено 27.12 36600/30-15 6 (21) 2 киЮ с при и,нением за ударственнык комитет(088.8) 1.78. Б 3) Оп ллетень Ъе 4ания 30.11.78 ликова 45) Д опублико ия опи Курило тельский итут свиноводства1 ЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ " - АЗЫ (К. Ф. 2.7.1.11) ЖИВОТНЫХ 4) СПОСОБ ОПРЕ ФОСФОФ РУКТОК В СПЕРМ(71) Заявитель Полтавский научно-исследо Изобретенне относится к способу определения активности ферментов в биологнческих "пканях,Известен способ определения,активности фосфофрупстоквн,азы в гомогенате печени н в сыворо"пке зароникоторый основан на образовавин фосфот 1 рноз из фруктозо- фосфата в арисутствии зкзогеннюй альдолазы 11.К векубационнюй среде, состоящей из 160 мкл трис-НС 1 буфера (рН 8,2), 10,5 мкл натрня метабнсульфата, 20 мкг щристадлической альдолазы, 5 мкл фруктозофосфата, 3 мкл аденюзивтрнфосфорной вислоты (АТФ), добавляют цент;рвфупат гомогенизнрованной тыави - О,2 мл, что соответствует 20 мг ткани. Конечный объем реакционной смеси 1 мл. После инкубащии н осаждения белков в "прихлоруисусном фильтрате ошределяют фосфотриозы, по количеству которых судят об активности фосфофруктокиназы.Недоста-пии известного способа заключаются в том, что ан "пребует добавления екзогенной альдолазы и дает недостаточно тонные результаты, так как часть фосфотриоз в инкубате изомЕрнзнруетсн трнозофосфатнзомеразой, что ведет к потере фосфютриоз,Цель изобретения - повызпенне точности определения.Для этого но нредлагаемому способу перед добавлением исследуемого материала вносят гиоразинсульфат для вапибирования триозофосфатизомеразы н хлористый магний для актвввровавия реакции, 1 и по содержанию фосфотрвоз нли Iо убыли фруктозы в реакционной смеси судят об актиолноспи фосфофрудстокнвазы.Предложенный способ определения активиоспи фосфофруктониназы основаи на образс 1 ва,нни фосфотриоз нз фруктозофосфата без добавления экзовенной альдолазы с учетом того, что в сперме естественно проявляегся высокая активность воследией. Кроме того, в ивкубационную смесь вносят активатор фосфофруктоеиназы в аиде 0,1 М раствора хлористого мапння.Предложенный способ более точен, потому что в инкубационную смесь вносят гидразинсульфаткоторый связывает фосфощриозы н тормозят трнозофоафа пизомеразу, вызывая сдвиг равновесия ферментативной реакции в сторону расщеплення фруктозо,6-дифосфата, а пакже обусловливает образование триоз в равном количестве.0,2580,1244 люг1000 - Х1000 12440,258 60 65 В анкубационную среду, состоящую из 0,5 мл 0,05 М раствора трис-НС 1 буфера (рН 7,8), 0,25 мл 0,14 М гидраэинсулыфата, 0,25 мл 0,03 М натрий метабисульфата, 0,25 мл О,ОЗ М аденозинПрифюсфорной кислоты наприевой соли, 0,25 лил 0,06 М фруктозо-б-фосфата, в качестве активатора фосфюфруйтоюнназы в каждую пробирку,вносят 0,02 мл 0,1 М распвора хлс 1 ристаго магния (МдС), добавляют 0,5 мл исследуемого материала и инкуби 1 руют 2 ч в водяной бане при 38 С. В контролыные пробы перед внесеним исследуемого материала вносят 2 мл 16%,ной трихлоруксусной кислоты. После инкубанни реакцию останавдивают внесением в нробы 2 лил прихлоруксуаной кислоты. Через 30 мин нробы,фильт;руют, К 1 мл фильпрата добавляют 1 лл 0,75 М раствора г 1 аОН, оспавляют на 10 мин при кюмнатной темпер атуредюбавляют 1 мл 2,4-динипрофенилвидразвна и пюдогревают 10 мин на водяиой бане 1 при 38 С. Довсдоят объем пробы 0,75 М распвором г 1 аОН до 8 мл и колорнметрируют нри 540 ммк (зеленый аветофильпр иа ФЭКМ. Стабильная оюраюка сох 1 раняется иа протяиении 15 мин.При отсутспнии хими 1 чеаюи чистых фосфоприаз можно;испюльзсивать щелочцолабилыный фосфор из фюсфатрвоз, образовавдихся в ходе ферсментапннной реаюпни. В 1 мл трихлоруксуаного фильтрапа определяют количест во щелочнолабилыного фосфора,по методу Фиске и Суббороу в модификацени Морпинсон и Виллакю (Лабоуаторное дело, 19 И, вып, 2). Свроят црафичеакую юривую, опкладывая на одной из юоюрдина т содержение фосфар а (мкг/мл фильтрапа), на другой - экс 1 тинкции.При расчете актианости учитывают, что 1 мкмоль фруктозо,6-дифосфата равен 22,4 лт=2 льмолям фосфотриоз=2 ммолям щелочнолабилыного фосфора или 62 мкг щелочнолабилыного фосфора, Полученное количеспво,щелочнюлабилынопо,фасфата в 1 мл фильпрата умножают,на 8 и получают акпивиость;в 1 мл исследуемого материала, Акпивность моиет быть выражена на 10 спермиев, на,1 ммз массы спермиев я на 100 ил спермы.Например, в 1 мл исследуемото иатериала выявлено 0,1244 мг щелочиолабильного фосфора. Консцентрация апермадиев в 1 мл, подсчитанная при помощи камеры Горяева, 0,258 млрд. Выачитывают пю прапор;ции активность на 10 спермиев: Если учесть, что,1 спериий имеет объем 125 мкз, и иолу 1 ченное количество обр,азовавшегося щелочнолабилыного фосфор а в 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ынюрограммах разделить на 125, то получнм активноать, выраженную в миюрограммах щелочнолабильнопо,фасфора на 1 млР482маосы апермиев, т, е. -- = 3,86 мкг/мм125сперсмиев, Если 1 лкмоль фруктозо,6-дифюсфата соответствует 62 мкг щелочнола 3,86 мкг билыного фосфа"па, то делнм= 0,062 мкмоля на 1 мм массы опермиев,Полученные дапоные об активности в 1 мл,исследуемого матернала умножаем н)а 100 и получа ем активиость в 100 мл онермы.Акпивность фосфофруктоюиназы 1 в сперме хряка мюоино определить по убыли фрукгпозы и иикубанисонной смести.В 1 мл трихлоруксусного фильтрата добавляют 1,5 мл О,О 5% нос о р аспвора резорпина н(а 96-июм зпилювом сп,ирте и 15 мл 0,216 М раствора железоаммонийнгх квасцов РеМН 4(ЯО 4) 2 12 НО;в конценпрированнюй содянюй юислоте, хорошо смешкивают и пробирюи контролыных и о)пытных проб эащрываюп,воздупвными холодилыннюами и ставят на 40 мин при 80 - 30 С в (водяную баню. Одновременно ста(вят стандар-пные щроб 1 ирюи с известной юонцентрацией фруктозы и слепую пробу, где вместо фильтр,ата берут 1 мл воды,Пригоповление станднр пной прюбы фруктозы; берут навеску (200 мг),фруктозы, высушенной до постояннюго веса в сушильном пиафу при 75 - 80 С, и распэоряют в 200 мл колбе в 0,1 М распворе соляной кислоты. Этот маточный раствар,может долго мр(аниться в холюдилынике. Из ма-почного распвора готовят рабочий. Для эпо 1 гю отме,ряют 1 мл маточного;р,аствора, 1 пвпеткой нносят в пробирку, туда же вносят 19 мл дистиллирадованиой воды, неаколько раз про,мьпвают пипепку втой,же водой:и весь раствор в )пробирке тщапелыно перемеши(вают, В 1 мл:рабочего раствора содержится 50 мкг фруктозы. Онределяют количеатво фруктозы вышеописанным резорцинювым методом в фильтрате и в стандарте. Фо"пометр,ируют пр,и 445 или 480 лмк, т. е. при аннем или синезеленам аветофильпре,на ФЭКМ. Далее по црапорции,высчитывают коспичеспво фруктозы,в исследуемом материале, полученное число умножают на 8, т, е. на разведение, и получают акпнвность;в 1 мл исследуемого материала. 3 атем, как,описано вьпше, делают переачет на 10 спер 1 м(иев, на 1 л 1 мз массы спермиев и на 100 мл исследуемого м атер,иала,Применение предложенного способа по. аводит с большей тснчностью юпределять активность фэсфофруктаниназы без п(рименевия не всегда доступной и дорогостаящей альдол азы.635424 Формула изобретения Составитель А. Макаров Техред С. АнтипенкоКорректор И. Симкина Редактор Н. Хубларова Заказ 754/11 б 3 Изд.710 Тираж 1080 Подписное НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Тип. Харьк. фил. пред. Патент Показатель актваноспи используется прпоценке качества спермы при искусственномосеменании жвво пных. Способ определавия активности фосфофруктскиназы,(к. ф. 2.7.1.11) (в сперме животных, включающий добавлеюие исследуемопо материала и реакционную омесь и инкубирование смеси, о т л и ч а ю щ и й с я том, что, с целью повышения точности опредегленияперед добавленнем исследуемого материала вносят глдразянсульфат для инпибирования вриозофоофатизомеразы и хлорпстый магний для активирования реак циии по содерканию фосфотриоз или птоубыли фруктозы в реакцианной смеси судят об активное пи фосфофруктоииназы. И сточнак информации, аринятый во10 вндмание при экспертизе: 1. 1.еа Ч. Л. апг 1 Иа 11 ег Р, С. - В 1 оспегп.,1 1965, 94, 665.