Способ изоэлектрического фокусирования белков

.Республик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ 8 У 96365(23) ПриоритетОпубликовано 23 11,82, бюллетень М 43 ы)м, л. 601 Й 27/26 Всударстмнай квннтвт СССР ао двлаи изобретений н отжатий(088.8) Дата опубликования описания 23 11,82 Г. Ю, Ажицкий, Г. В. Троицкий и В. Ф, Петренко(71) Заявитель Крымский медицинский институт( 54) СПОСОБ ИЗОЭЛ ЕКТРИЧЕСКОГО ФОКУСИРОВАНИЯ БЕЛКОВ Йзобретение относится к электрофорезу в рН градиентах,Известен способ изофокусирования, основанный нв том, что в буферном растворе стандартной прописи создается градиент5 концентрации органического растворителя и при этом также индуцируется градиент рН 1 Йаиболее близким к предлагаемому 1 О является способ изоэлектрического фокусирования, основанный на том, что градиент рН создается градиентом концентрации полиолов в боратном буфере. В стеклянной трубке в среде боратного буфера 15 создается градиент концентрации полиола, например маннита, ксилита, или глицерина. При этом автоматически образуется градиент рН. Образец белка, растворенный в боратном буфере или диализованный проо тив боратного буфера, вносится в эту же трубку, К ее обоим концам подключают постоянный электрический ток, под действием которого белок концентрируется вобласти своей изоэлектрической точки ( 2Однако для целей концентрированиябелков известный способ не применяется,так как эффект концентрирования незначителен вследствие того, что рН градиентраспределен по всей длине трубки,Целью изобретения является повышениестепени концентрирования белка при егоизофокусировании,Указанная цель достигается тем, что электрофорез белков проводят а ступенчатом градиенте рН, который формируют путем заполнения колонки боратным буфером с рН 89 - 9,1 на 1/8 - 1/10 объема колонки добавления ксилита до концентрации 60 - 70% в борвтном буфере и рН 4,0 - 4,2 и заполнения оставшегося объема колонки исходным боратным буфером с пробой белка,Такой способ концентрации белка применим для 85 - 90% всех известных белков, изоточки которых находятся и диапвформула изобретения5 3 97636зоне рН 4,0 - 9,0. Так как процесс изофокусирования происходит в очень незначительном объеме растворителя, примерно0,5 мл, следовательно, и степень концентрирования достаточно высока.3П р и м е р 1. Изофокусирование сцелью концентрирования смеси белков, состоящей из 0,01% альбумина и 0,01%гемоглобина, проводили на колонке дляиэофокусирования в борат полиольных сисйтемах. Для этого данные белки растворяли до указанной концентрации в 0,01 мборно боратном буферерН 9,0. Затем вколонку наливали 5,0 мл 60% ксилита,растворенного в этом же буфере, послечего его рН снижалась до 4,0 и затемнасосом наслаивали 45 Йл раствора белка. Колонку подключали к источнику постоянного тока при градиенте потенциала20 в/см. Опыт проводили в течение 6 ч.Уже через 30 мнн на границе разделазначений рН набл.одели концентрированиегемоглобина. После окончания опыта окращенная зона была отобрана в объемеО,5 .ф 0,6 мл, На основании спектрофото-,метрического определения концентрациибыло показано, что весь внесенный белок:сконцентрирован,П р и м е р 2, Концентрирование белков мочи. К 50 мл мочи, полученной отбольного нефритом, была добавлена бурас целью образования в ней буферного раст.вора с рН 9,0 и концентрацией 0,01 м.После этого 45 мл мочи было наслоенона 5,0 мл раствора ксилита, как и при 35мере 1. фокусирование вели в течение 51 ч при 10 в/см и в течение йоследуюших 6 ч при 20 в/см. Через 7 ч изофо-кусирования опалесцирующий белок былвизуально обнаружен на границе разделарН. Количественный анализ показал, чтоконцентрация до фокусирования была равна 0,001%, а после фокусирования 0,09%.то есть белок был сконцентрирован в,90 раз. Если для этой цели применитьизвестный способ, то удается повыситьконцентрацию белка не более чем в 2 раза. Способ иэоэлектрического фокусирования белков, включающий электрофорезбелков в градиенте рН в колонке с боратным буфером, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повыщения степенй концентрирования белка, электрофореэбелков проводят в ступенчатом градиенте рН, который формируют путем заполнения колонки боратным буфером с рН8,9 - 9,1 на 1/8 - 1/10 объема колонки, добавления ксилита до концентрации60 - 70% в боратном буфере и рН 4,04,2 и заполнения оставщегося объемаколонки исходным боратным буфером спробой белка.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Авторское свидетельство СССРИо 442801, кл. А 61 К 27/10, 1972.2. Доклады АН СССР 1974, 214,с, 955 - 958.Составитель Т, Чечеватова Редактор В. Иванова Техред М.Гергель Корректор У, Пономаренко Ф Заказ 8996/72 Тираж 887 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раущская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент, г. Ужгооод, ул, Проектная, 4