Способ получения эргозина

(ЗЗ) гДР осударственный номнтет СССР ао аеяан нзобретеннй н отнрытнй(31) МР С 1.2 О / ОпублиКовано 070982, БюллетеньЛата опубликования описания 07098(53) УД) гъ 678. О .29(088,8) Иностранцы егер Детлеф, Ммаудер Хана-Т 1 ете Майер Валтер и Грге Дитер(73) За 4) СПОСОВ ПОДУЧКНИЯ ЭРГОЗ 1 кро- и ка ИзобретЕНие относитсЯ к мибиологической проьыаленностисается получения зргозина,Известен способ получениявенных алкалоидов из спорыньОднако этот способ позволчить небольшое количество эрКроме того, присутствуют родпектидные алкалоиды, которыеотделять друг от друга.Цель изобретения - получензина. тести.яет пслугозина,ственныесложно голь достигается тем, что луче ни я эр гози на осуществля культивирования штамма С 1 агрцгеа ( Рг) Тц) МУТ 168 в глубинных или поверхностных в жидких питательных средах х источники углерода, азота ьные соли, при 20-30 оС и 2 в течение 10-35 дней и алкалоиды известным путе ом культивирование ведут ОС и рН 5,2-5,9.штамм выделен из диких ПУР 13, ПУР 50) вида С)ач цгеа (Рг )Тц 1 на ржи растуобразующих Эрготамин.йной мутации этих штаммэв а ь- каовых средах колонии сос олее или менее сильно ра о мицелия, который имее 5 мк, в узлах разветлеКонидии отсутствуют, н ятых средах, вызывающих е спор, мицелий распада- но на довольно мелкие зт На ага м. тоят из б ветвленно 25 толщину 4 ния 7-8 м в общепри. щих образован ется част части.Новый штаммов серь рцг склероти После двч способ поют путемч 1 серь рцаэробныхусловияхсодержащии минералрН 4.,0-6,выделяютПри этпри 22-25 была изолирована линия, которая способна образовывать зргозин. В ходе этих работ стало возможным превратить сапрофитично свободные от алколоидов дикие штаммы в производя: щие линии и одновременно переключить спектр алколоидов относительно 5 Ц 1 егой 1 цщ.Выделениый штамм С 1,рцгрцгеа (Рг)Тц 1 МУТ 168 зарегистрирован под номером УМЕТ РА (ИМЕТ ПА/134 в центральном исследовательском институте микробиологии и экспериментальной терапии АН ГДР в г. йена). Штамм образует эргозин и его изомер зргози нин до 90.и только 10 легко отделяемого смеси клавина.Штамм обладает следующими кул турально-морфологическими призна ми.Капли жира в относительно маломколичестве обнаружены только насредах 846 и 829. Мицелий глубинныхкультур состоит из длинных разаетв -ленных гифов толщиной около 5 мк,Гифы имеют частично шаровидно округленные утолщения и содержат много капель жира.Среда М 10 - рост очень хорошийсо складчатой и частично приподнятойповерхностью, коричневая пигментация,обратная сторона с частично темнымипятнами, без конидий.Среда 846 - рост хороший, колониисо складчастой извилистой поверхностью, коричневая обратная сторонасветло-коричневая без конидий.Среда 829 - рост хороший, колониисо светло-коричневой до коричневойпигментацией, со складчатой поверхностью, курчавым и неравномернымкраем. Обратная сторона светло-коричневая.Среда 784 - рост хороший, колонии имеют коричневую верхнюю сторонуи бесцветную нижнюю сторону, колонии складчатые, волнистые с неровным краем, без конидий,Культивирование штамма лучше всего идет в жидких питательных средахв поверхностных или глубинных условиях.Питательные среды содержат источник углерода, который может быть ассимилирован, как, например, сахароза, глюкоза, маннит, сорбин, глицеринлимонная или янтарная кислота, ассимилируеьый источник азота, напримераммоний, аспарагин, пептон, гидролиз казеина или соль аммония и мине -ральные соли.Ферментация может проходить вколбах Фернбаха, Эрлен-Майера, в качалочных колбах или в ферментерах.Алкалоиды в большинстве (выше 80)содержатся в питательных средах и ихможно получить обычным путем,Культивирование проводят односту-,пенчато, двухступенчато или трехступенчато, Желательно, если предвари-.тельные культуры 5-12-дневного возраста и соотношение внесения предварительных культур к основным культурам равняется 1:5 (до 1:20). Значение рН может колебаться от 4,06,2, а температура от 20 в 30.П р и м е р 1.Штамм МУТ 168со скошенного агафа гомогенизируютв 100 мл среды 821 и вносят в качалочные колбы объемом 500 мл, Средаимеет следующий состав:Сахароза, г 200Цитрат аммония, г 15Са (Оо); г 1КН,РО 4,г 0,25о 9507 Н и О, гГе 50, 7 НиО, мг102 п 5 О 7 НО, мг 30,8, рН (перед стерилизацией) 5,8-6,05 Стерилизация 30 мин при 110 С.Колбы культивируют 7 дней при241 С при 200 об/мин.10 полученных культур используют для того, чтобы в 500 мл копбы10 внести 100 мл среды 720 следукщегосостава:Сахароза, гЦират.аммония, гСа(ЙО),г15 кнР О,О 95047 Н 10, гГе 504 7 НО, мгЕп 5 О, 7 Н 70, мгКС 1, г. Вода, лрН (перед стерилизацией) 5,8-6,0Стерилизация 30 мин при 110 С.Колбы инкубируют 7 дней при 24 + 1 Си 200 об/мин,После .12-21-дневного инкубирования при вышеуказанных условиях культуральная жидкость содержит 180280 мкг/мл алкалоида с содержаниемдо 90 смеси эргозина и эргозининаи 10 смеси клавиналкалоида. Алкалоиды выделяют известным способом иочищают. 2001510,250,31030,80,1До 1 П р и м е р 2. 10 описанной ЗУ в примере 1 исходной культуры переводят в колбы Фернбаха объемом 400 мпсо 100 мп среды 720. При 24 + 1 Сколбы культивируют и после 20 днейкультивирования надводный мицелийотделяют от среды. Колбы содержат250-350 мг общего алкалоида на 1 млпитательной среды, .имеющей такой жесостав, как в примере 1.Определение алкалоидов проводят следующим образом.После 20-дневной. ферментации поверхностная культура содержит300 мг/мп смеси алкалоидов. 10 млподщелачивают и проводят экстракциюхлороформом. Объем экстракта умень шают до 5 мл и 2 мл из них отделяют послойным хроматографированием препаратана силикагеле с флюоресцентным индикатором (система. растворителя хлороформ-этанол (8:2) ) .55 Алкалоидные пятна снимают, добавляют к смеси вода-метанол-ледянаяуксусная кислота (45;45:10) и смешивают потом с реактивом Ван-Уркав соотношении 1:2. Окрашенные в го лубой цвет растворы центрифугируют,надосадочную жидкость облучают кварцевой лампой 5 мин и определяютэкстинкцию фотометром. Количествоалкалоида определяют из составленных 65 пои одинаковых условиях эталонных956560 35 Формула изобретения Составитель С. МалютинаРедактор Н. Киштулинец Техред Е.ХаритончикКорректор Е,Рошко Заказ 6519/5 Тираж 505 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытийФилиал ППП "Патент", г, УжГород, ул, Проектная, 4 кривых. Смесь алкалоидов этого штамма имеет следукщий состав, %:Эргозин 65Эргозинин 25Клавин ал к алоиды 10Препаративное получение пептидных алкалоидов осуществляют следующим образом.2, 5 л питатель ного раствора подщелачивают (рН 9) и экстрагируютхлороформом. Очищенный экстракт выпаривают в вакууме. Получают 690 мгсырой смеси алкалоидов.Этот материала растворяют в небольшом количестве хлороформа и хроматографируют в колонке на силикагеле. Элюирующим раствором служитхлороформ, к которому добавляютповышающеееся количество этанола(до 15). Образуются две разделенныеФлюоресцирующим голубым цветом вультрафиолетовом свете эоны. Быстроперемещающаяся эона дает эргозинин.После перекристаллизации из метанолаполучают 150 мл эргозинина (Сс Н 05 й 5),т.пл. 225 Сд-=. + 394 (с = 1Э.хлороформа).Масс-спектр высокого разрешениям/е: 54 7 (М + ), найдено 5472807,рассчитано 54 7, 2 79 4 для С 3 Н 3 05 М 5 .Другие выступающие фрагиейты и/е:280, 267, 224, 221, 210, 167, 154.Элюат медленно перемещающейся зо.ны содержит 350 мг эргозина(СЭО Н 3 05 Н 5) . Масс.-спектр м/е:547 (М+) .В обоих случаях реакция Келлераи Ван-Урка положительны:и спектрпоглощения в ультрафиолетовом светеимеет максимуь 1 при А = 312.При кислом гидролизе образуетсялейцин и пролин. При щелочном гидролизе получаются лизергиновая кислота (эргозин) или изолизергиноваякислота (эргозинин) .Хрэматографические свойства обоихвыделенных пептидных. алкалоидовсовпадают с аутентичным эргозиномили эргозинином,Превращение алкалоидов друг в друга возможно обычными методами.П р и м е р 3. Штамм со скошенного агара примера 1 гомогенизируютв 100 мл среды 815 и вносят в качалочные колбы объемом 500 мл. Среда имеет следующим состав, г.Сахароза 300КНРО+ 0,5НаКОЗ 2,0Дрожжевой экстракт 0,1М 95 04 7 Н О 0,6КС 1 0,.5Ге 504 7 НО, мг 10Вода, л До 1рН до стерилизации 5,5-5,8 1 О Стерилизация 30 мин при 110" С.После инкубирования при тех же условиях, как в примере 1, 10 исходнойкультуры переводят в колбу объемом500 мл с 100 мл среды 833 следукхце.5 го состава, г:.Сахароза 300Цитрат аммония 20Са (НО) 1КНР 04 0,25 20 М 9504 7 НО 0,3Ге 50 7 НО, мг 102 п 504 7 Н 0, мг 30,8Вода, л До 1рН до стерилиза 25 ции 5,4-5, 7Стериализация 30 иин при 110 СПосле 14 дневного инкубированияколбы содержат 180-200 мг/мл общегоалкалоида того же состава, .как.в при мере 1.Предложенный способ позволяет получить эргозин микробиологическим путем,что упрощает технологию производства. 1. Способ получения эргозина, о тл и ч а ю.щ и й с я тем, что штамм 4 О С 1 ач 1 серь рбгрцгеа (Гг) То 1 МУТ 168культивируют в аэробных глубинных илиповерхностных условиях в жидких питательных средах, содержащих источники углерода, азота и минеральные 45 соли, при 20-30 С и рН 4,0-6,2 встечение 10-35 дней и выделяют алкалоидыизвестным способом,2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что культивированиеведут при 22-25 еС и рН 5,2-5,9.Признано изобретением по результатам экспертизы, осуществленнойВедомством по изобретательству Германской Демократической республики.