Способ определения ферментативной активности моноглицеридлипазы

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистических Республик 2 ц 918853(5)М Кд С 01 И 33/48С 12 Я 1/34 с присоединением заявки,В тоаударстаопей квинтет СССР в делан. изебретеиий к аткрытийГеИ.Я,Медкова, К.В.Смирнов и Б.П,СуриновНаучно-исследовательский институт медиц скойрадиологии АМН СССР и Институт медико-биологических "проблемсд(71) Заявители 1.54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ МОНОГЛИЦЕРИДЛИПАЗЫ Изобретение относится к области анализа ферментных реакций и может быть использовано при определении активности моноглицеридлипазы в биологических средах, в частности для диагностики заболеваний кишечника, когда меняется активность этого фермента в слизистой оболочке кишечника, его содержимом и кале, и в научно-исследовательских лабораториях . при экспериментах на животных.Известен способ определения Ферментативной активности моноглицерид липазы (моноглицеридгидролаэа) а слизистой оболочке тонкого кишечника, включающий приготовление пробы; Ферментативный гидролиз липидного субстрата под действием Ферментов испытуемой пробы, экстракцию жирных кислот, освободившихся при гидролизе, зт и определение ферментативной актив" ности моноглицеридлипазы по количеству освободившихся в единицу времени жирных кислот титрованием щелочью. Величину активности моноглицеридлипазы рассчитывают, исходя из количества освободившейся в единицу вре" мени олеиновой кислоты 1,1.Недостатками данного способа определения активности моноглицеридлипазы является его ниэкая чувствительность и точность, сложность технологии анализа, а также невозможность определять активность в содержимом кишечника и кале, Низкая чувствительность обусловлена тем, что для проведения анализа требуются большие количества Ткани кйшечника (целые его сегменты до 1-2 г массой) и необходимостью выделять иэ клеток микросомальную Фракцию, Низкая точность обусловлена невозможностью получить стандартную эмульсию субстрата, не" обходимостью удалять из кишечника отмыванием панкреатическую липазу, способную гидролизировать эмульсии липидов, чтоприводит к частичной потере и моноглицеридлипазы, исполь3 9188зованием титрометрицеского определения освободившейся жирной кислоты,что,вносит дополнительную ошибку засчет субъективности определения окончания титрования.5Технологическая сложность анализа данным способом вызвана необходимостью лабораторного синтеза моноолеина, его последующего эмульгирования, выделения микросомальной фракции. Невозможность применять данныйспособ для определения ферментативной активности моноглицеридлипазы всодержимом кишечника и кале связанас высоКим содержанием в них панкреатической липазы, которую нельзя удалить, но которая гидролизует эмульсиилипидов (в данном слуцае моноолеин) .Ошибка данного способа 10-124, авремя, необходимое для выполненияанализа 1 О проб - 5-6 чел,-ц.Цель изобретения - повышения чувствигельности и точности способа,а также упрощение процедуры анализаи достижение возможности определятьферментативную активность моноглицеридлипазы в содержимом кишечникаи кале.Эта цель достигается тем, что вкачестве субстрата используют водный раствор диоксиэтиленсорбитанмонолаурата в концентрации 70-75 мг/млв трис-буфере с рН 7,5-8,5,. Послеего инкубирования с испытуемой пробой определяют количество освободив 35шейся лауриновой кислоты путем фотоколориметрического определения окрашенного комплекса лаурата меди с хромогенным комплексообразователем.Аксивность моноглицеридлипазы рас 40считывают по количеству освободившейся лауриновой кислоты в единицувремени на единицу массы ткани кишечника или кала.43П р и м е р 1. (концентрациясубстрата 70 мг/мл трис-буфера рН7,5), 0,1 мл испытуемой пробы (экстракт 50 мг слизистой оболочки тонкого кишечника крысы в 1 О мл воды)смешивали с 1 мл раствора диоксиэтиленсорбитанмонолаурата концентрация70 мг/мл) в трис-буфере с рН 7,0,инкубировали 10 мин при 37 С,добавляли 7 мл смеси хлороформа с гептаном (в соотношении 3:2), встряхивали4-5 мин, добавляли 3,5 мл медногореактива (5 млМ уксусной кислоты,7,6 мл триэтаноламина, 2,38 г азотнокислой меди, 60 мл воды, рН 8,3),53 4встряхивали 0,5 мин, из верхней фазы отбирали 3 мл и добавляли 0,5 мл хромогенного комплексообразователя (диэтилдитиокарбаматмг/мл в смесин-бутанола и хлороформа в соотношении 3:2), окрашенный раствор фотоколориметрировали при 435 нм. Определяли количество лауриновой кислоты, освободившейся при ферментативномгидролизе субстрата, по калибровочнойкривой.Контрольная проба, Испытуемую пробу добавляли после 10 мин инкубирова 0ния при 37 субстратного раствора и добавление 7 мл смеси хлороформа сгептаном. Активность выражали в мкмоль лауриновой кислоты, освободившейся при Фрементативном гидролизе субстрата в мин на 1 г слизистой оболочки тонкого кишечника, Результат - 35,8 мкмоль/мин.г.П р и м е р 2.(концентрация субстрата 72,5 мг/мл в трис-буфере рН 8,0), 0,1 мл испытуемой пробы (экстракт 50 мг слизистой оболочки кищецника в 10 мл воды) смешивали в 1 мл раствора диоксиэтиленсорбитанмонолауратаконцентрация 72,5 мг/мг в трис-буфере с рН 8,0, инкубировали 10 мин ври 370 С,добавляли 7 мл смеси хлороформа с гептаном (в соотношении 3:2), встряхивали 4-5 мин, добавляли 3,5 мл медного реактива (5 мл уксусной кислоты, 7,6 мл триэтаноламина, 2,38 г азотнокислой меди, 60 мл воды, рН 8,3) встряхивали 0,5 мин, из верхней фазы отбирали 3 мл и добавляли 0,5 мл хромогенного комплексообразователя .(диэтилдитиокарбамат 1 мг/мл смеси н-бутанола и хлороформа в соотношении 3:2), окрашенный раствор фотоколориметрировали при 435 нм. Активность моноглицеридлипазы рассчитывали по количеству освободившейся при ферментативном гидролизе субстрата лауриновой кислоты, определяемого по калибровочной кривой.Контрольная проба. Испытуемую пробу добавляли после 10 мин инкубирования субстратного раствора прио37 С и добавления 7 мл смеси хлороформа с гептаном, Активность выражали в мкмоль освободившейся лаури- новой кислоты .в мин на 1 г слизистой оболочки тонкого кишечника. Результат - 38,1 мкмоль/мин,г.П р и м е, р 3. (концентрация субстрата 75 мг/мл в трис-буфере,ВНИИПИ Заказ 2129/27 Тираж 883 Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 5рН 8, 5), О, 1 мл испытуемой пробы (экстракт 50 мг слизистой оболочки тонкого кишечника крысы в 1 О мл воды) смешивали с 1 мл раствора диоксиэтиленсорбитанмонолаурата (концент 5 рация 75 мл/мл) в трис-буфере рН 8,5, инкубировали 1 О мин при 37 С, добавляли 7 мл смеси хлороформа с гептаном (в соотношении 3:2), встряхивали 1-5 мин, добавляли 3,5 мл мед О ного реактива (5 мл уксусной кислоты , 7,6 мл триэтаноламина, 2,38 г азотнокислой меди, 60 мл воды, рН 8,3), встряхивали 0,5 мин, из верхней фазы отбирали 3 мл и добавляли 0,5 мл хромогенного комплексообразователя (диэтилдитиокарбамата 1 мг/мл смеси н-бутанола и хлороформа в со" отношении 3:2), окрашенный раствор фотоколориметрировали при 435 нм.Активность моноглицеридлипазы рассчитывали по колицеству освободившейся при ферментативном гидролизе субстрата лауриновой кислоты, определяемого по калибровочной кривой.Контрольная проба. Испытуемую пробу добавляли после инкубации субстратного раствора 1 О мин при 37 С и добавления смеси хлороформа с гептаном. Активность выражали в мкмоль ос- зо вободившейся лауриновой кислоты в мин на 1 г слизистой оболочки тонкого кишечника. Результат 37,6 мкмоль/мин. г.Предложенный способ определения ферментативной активности моногли 35 церидлипазы имеет высокую чувствитель ность (в 50 раэ выше, чем в известном способе по количеству требующейся для анализа ткани), а также и по минимальной определяемой активнос. ти фермента. Это позволяет определять активность моноглицеридлипазы в малых образцах проб, а также в кале.В предлагаемом способе отсутствует гидролиз используемого субстрата панкреатической липазой. Это свидетельствует о его точности (специфичности) - присутствие панкреатической50 3 6липазы в испытуемых объектах не искажает результаты анализа, Ошибка способа 5-6 Ф.Предлагаемый способ обладает технологической простотой и в 2-3 раза более высокой производительностью, чем известный способ.Для проведения анализа 20 проб требуется 3 чел,-ч.Способ определения ферментативной активности моноглицеридлипазы ( в кале, содержимом кишечника, биопсийных образцах слизистой оболочки кишечника)может быть применен для клинико-диагностических лабора", торий при диагностике заболеваний желудочно-кишечного тракта (ферментативная недостаточность, воспалительные процессы и др.). Способ определения ферментативной активности моноглицеридлипазы,включающий приготовление пробы,ферментативный гидролиз липидного субстрата под действием ферментов испытуемой пробы, экстракцию жирныхкислот, освободившихся при гидролизе, и определение ферментативнойактивности моноглицеридлипазы поколичеству освободившихся в единицувремени жирных кислот, о т л и -ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения чувствительности и точности определения и упрощения способа,в качестве субстрата используютраствор диоксиэтиленсорбитанмонолаурата в концентрации 70-75 мг/мл втрис-буфере в рН 7,5-8,5, а количество освободившейся лауриновойкислоты определяют фотоколориметрицески в виде окрашенного комплекса лаурата меди с хромогенным комплексообразователем.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. 3. Вю 1 СЬщ, 1966, ч. 211.,р. 2306.