Способ определения биологической активности химических соединений

ОП ИСАНИЕ и 918854ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскикСоциапистичесиикРеспублик(22) Заявлено 360980 (21) 2991444/30-15, (1) М. КЛ. 6 01 М 33/48 С 01 И 24/00 с прнсоеаннениен заявки,% 9 щдарсткккай кквнтат СССР а дедам изобретений и открытий(088.8) Дата опубликования описания ОУ 04 В 2 Н.И.Эмануэль, К.Е, Круглякова и Л.Я. Ген 4 ель "-". - .,и О.И.ПанасенкоГОрдена Ленина институт химической физикАН СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХИИИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙИзобретение. относится к физико" химическим методам выявления потенциальной биологической активности химических соединений как структуромодифицирующих факторов в отношении биологических мембран и может быть использовано при поиске практически ценных биологически активных препа-ратовнапример пестицидов.Известен способ определения биоло" гической активности химических сое 16 динений, в котором в качестве тест- объекта используют либо подопытных животных, либо ткани их различных органов. Измельченные ткани гомогенизируют, подвергают воздействию ис" пцтуемого химического соединения,В гомогенатах и субклеточных фрак" циях определяют свободную и общую активность гликозида. Общую активность ферментов исследуют после пол" ного разрушения субклеточных струк" ту"р путем добавления в инкубационную среду тритона Х. 2По изменению уровней активности этих ферментов определяют биологическую активность испытуемых соединений 1.Однако известный способ предусматривает использовать в качестве тест" объекта либо ткани различных органов подопытного животного, либо организм в целом, что затрудняет однозначную интерпретацию механизма действия испытуемых соединений. Способ дает воэможность судить только о функцио" нальнцх изменениях лизосомальных ферментов и не дает никакой информации о структурной модификации мембран при воздействии химических соединений.Кроме того, известный способ тру доемок и предусматривает проведение эксперимента, по крайней мере, в те" чение суток,Целью изобретения является ускорение способа, повышение его чувствительности и информативности.3 9Поставленная цель достигается тем, что согласно способу в качестве тест- объекта используют плазматические мембраны эритроцитов животных организмов, после воздействия на тест-объект5 химическими соединениями в негр вводят спиновой зонд в концентрации 0,1-0,5 мИ, добавляют аскорбат натрия в концентрации 10-25 мМ, затеи измеряют скорость аскорбат-индуциро 0 ванного восстановления зонда, по изменению которой судят о биологической активности химических соединений.Скорость восстановления зондов обусловлена скоростью проникйовения аскорбат-аниона во внутримембранное пространство, а последняя, в свою очередь, существенным образом зависит от структурного состояния мембраны, которое может изменяться при обработке мембраны биологически ак 20 тивными препаратами. Измеряя, таким образом, скорость восстановления зондов, локализованных в обработанной химическими соединениями мембране, аскорбатом натрия и сравнивая ее с таковой при отсутствии химических соединений (контроль) определяют биологическую активность испытывае" мых веществ как структуро-модифици 30 рующих Факторов в отношении биомембран.На чертеже представлены кинематические кривые восстановления зонда.П р и м е р. Плазматические мемб- Зф раны эритроцитов, так называемые "тени" эритроцитов, получают из свежей бычьей крови. Для этого эритроциты отделяют от плазмы центрифугированием в течение 20 мин при 1000 ц, 40 затем трижды промывают раствором 0,94-ного хлорида натрия, центрифугируя в течение 15 мин при 1000 д. Далее проводят гемолиз в растворе трис-НС 1 (5 мИ, рН 7,8), содержащем фф 2 мИ ЭДТА, 1 мИ сульфата магния. Смесь центрифугируют 15 мин при .15000 д. Супернатант удаляют. Подобную операцию повторяют 3 - 4 раза. Отношение объема эритроцитов к ф объему гомолизата поддерживают 1:10. Затем ионную силу буфера по" нижают в 2 раза(трис-НС 1 - 2,5 мМ, рН.7,3, 2 мИ ЭДТА, 1 мИ сульфата магния) и гемолизат вновь центрифугиру- И ют при 15000 Р в течение 15 мин. Супернатант удаляют (операцию повторяют 2 раза) . Последнюю стадию от 18854,фмывки "теней" от гемоглобина прово-,дят в растворе трис-НС 1 (1 мИ, рН7,8) при 20000 Р в течение 15 мин(2 раза), Полученную суспензию концентрируют путем центрифугированияпри 100000 д в течение 30 мин, предварительно суспендируя ее в растворетрис-НС 1 (50 мМ, рН 7,8). Все операции по получению "теней" осуществляют при 1 - 6 С.ЭПР-измерения проводят на радиоспектрометре РЭпри 18-20. К100 мкл полученной суспензии мембран(концентрация белка по Лоури составляет 12,5 мг/мл) добавляют спиртовый раствор.ДДТ так, чтобы концентрация ДДТ в среде измерения составляла 0,5 мМ. Смесь инкубируют 60 минпри комнатной температуре, затем добавляют спиртовый раствор зонда(2,2,1,4-тетраметил-гексил,2,3,4-тетрагидро,6-бензокарболин-оксил) причем конечная концентрация зонда равна,2,5 х 10 И, а этанола - не более М по объему. Смесьинкубируют 30 мин при комнатной температуре, после чего добавляют раст"вор аскорбата натрия в буфере трис"-НС 1 50 мИ; рН 7,8. Суспензию тща"тельно перемешивают и через 510 мин регистрируют 2 спектра ЭПР синтервалом 3 мин, Определяют соотношение центральных компонент спектров. Оно составляет 0,89. По номограмме (чертеж) находят, что значение Ь 0,017 мин "Контроль. К 100 мкл полученнойсуспензии "теней (концентрация белка по Лоури составляет 12,5 кг/мл)добавляют спиртовый раствор зонда(2 2,4,1-тетраметил-гексил"1,2,3,4-тетрагидро,6-бензо-у-карболин"оксил) так, чтобы конечная концентрация этанола в среде измерения непревышала 44 по объему, а зондасоставляла 2,5 х 10 4 И. Суспензиюинкубируют 30 мин. при комнатной температуре, Затеи к полученной смесидобавляет раствор аскорбата натрияв буФере трис-ЯС 1 (50 мИ, рН 7,8),начальная концентрация которого составляет 17,5 мИ, Смесь тщательно перемешивают и через 5-10 мин регистрируют 2 спектра ЭПР с интервалом3 мин, Определяют соотношение интенсивностей центральных компонентспектров ЭПР, Оно составляет 0,81.По номограмме (чертеж) определяютЕо для этой реакции (1 д=0,030 мин).О 550 1-1 с 73 со Препаратгде с - концентрация испытуемого пре 1)10,00 110,00 1500-4000 ЛинуронДилор 5000-9000 Использование в качестве тест- объекта "теней" эритроцитов животных организмов для определения биологической активности химических соединений имеет следующие. преимущества; повышается информативность способа, так как, с одной стороны, плазматические мембраны зритроцитарных клеток непосредственно взаимодействуют с биологически активными веществами, попадающими в кровь организма из биосферы, а с другой стороны, структурное состояние мембраны является одним из определяющих факторов функционирования зритроцитов, а значит и организма в целом; "тени" однородны по составу и относительно легко мо" гут быть получены, можно легко получить инвертированные "тени", что дает возможность изучать влияние хи" мических соединений не только на внешнюю, но и на цитоплазматическую поверхность мембраны; "тени" представляют собой препарат, по существу, не загрязненный компонентами других органелл клетки и ее .цитоплазмы,Использование в качестве спиновых зондов нитроксильных радикалов, отличающихся физико-химическими свойствами и локализацией в биомембране, увеличивает чувствительность способа и позволяет получать дополнительную информацию о структурной модификации различных ее областей. Преимущества предлагаемого способа заключаются также в возможности работы с микроЕр - константа скорости реакциипри отсутствии химическогосоединения;1 с - константа скорости реак ДДции в присутствии химичес"кого соединения;Со - концентрация химическогосоединения, вызывающаяуменьшение Е/Мо на 504.В качестве параметров, характеризующих скорость реакции, могут бытьвыбраны начальная скорость восстановления радикальных центров опре"деляется как тангенс угла наклонакасательной к кинетической кривойвосстановления зонда в начальныймомент времени), время полувосста"новления радикалов и константа ско" . рости реакции определяется как тангенс угла наклона полулогарифмических анаморфоз .кинетических кривых).Строят зависимость Ч/Ч 0, (Т/Т3 с/)с,где Чо, (Т 1.)О ф .10 и Чь Т 1 щ,ф начальная скорость восстановления зондов аскорбатом, время полувосстановления, константа скорости реакции при отсутствии и в присутствии испытываемого соединения соответст: венно, от концентрации испытываемого химического соединения:Зная отношение интенсивностей центральных компонент двух спектров ЗПР Ь, и Ь записанных через интервал времени йС, можно определить константы скорости реакциии Е О по номограмме (чертеж).По аналогичной методике было изучено влияние фозалона, пентахлорфенолята натрия ПХф"Иа), роннела, линулона, дилора на структуру эритроцитарной мембраны. В таблице приведе" ны оцененные значения Со для всех исследованных соединейий, а также указаны их дозы, вызывающие 50-ную гибель подопытных животных (ЛДО)Л ф Следует обратить внимание на тот факт, что между величинами Си ЛДр существует корреляция. Чем боль ше ЛДоф т,е, чем менее токсичным является соединение, тем больше Со . зз Зто расширяет возможности предла" гаемого способа и позволяет оцени" вать токсические свойства испытуемых Ьв отношении животных оргаформула изобретения НИИП Заказ 2129/27 Тираж 883 Подписно е еввеееве вевеевввеее лиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 7 91 количествами веществ (максимальное количество необходимого вещества не превышает 5 мг) и автоматизации пров цесса первичного скрининга химических соединений.Предлагаемый способ позволяет получить быструю информацию а биологической активности химических соединений в течение 30 - 100 мин. Способ определения биологической активности химических соединений путем их воздействия на тест-объекты, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения способа, повыше 8854 8ния его чувствительности и информативности, в качестве тест-объектаиспользуют плазматические мембраныэритроцитов животных, организмов, пос" з ле воздействия на тест-объект химическими соединениями в него вводятспиновой зонд в концентрации О, 1 е0,5 мй, добавляют аскорбат натрия вконцентрации 10-25 мИ, после чего 10 измеряют скорость аскорбатеиндуцироеванного восстановления зонда, поизменению которой судят о биологической активности химических соеди нений.13 Источники информации,принятые во внимание при экспертизе Авторское свидетельство СССР Н 675649, кл, С 01 И ЗЗ/16,02.02.76.