Способ приготовления давленых препаратов хромосом хлопчатника

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИяК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскикСоциалистичесиикРеспублик и 880364вв делам изебретеиий и вткрытийОпубликовано 15.11.81, Бюллетень М 42 Дата опубликования описания 8.11.81(72) Авторы изобретения Ю.М. Агаев и Т.К. Агаева Институт генетики и селекции АН Азербайджанской ССР(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДАВЛЕНЫХ ПРЕПАРАТОВ ХРОМОСОМ ХЛОПЧАТНИКА Изобретение относится к цитологии и селекции растений и может быть использовано в сельском хозяйстве.Известны способы приготовления давленых препаратов хромосом растений: ацето-карминовый, ацетолакмоид- ф ный, ацето-арсеиновый, ацето-железогеиатоксииииааый 1.Однако эти способы на хлопчатнике дают неудовлетворительные результаты.Известен также способ приготовления давленых препаратов для изучения метафазных хромосом хлопчатника, при котором хлопчатник намачивают,в касторовом масле 24 ч, затем тщательно промывают и помещают в термостат для15 проращивания. У проростков корешки фиксируют в смеси Левитсксго (1:1), промывают в проточной воде, обезвоживают спиртом, мацерируют в 207-ном растворе едкого натра, выдерживают26о в ацето-железо-гематокислине при 40 С более 3 ч, подогревают вместе с красителем на спиртовке 3-4 мин, затем удаляют корневой чехлик и получают 2-3 среза кончика корешка, которые укладывают на предметное стекло в каплю . просветляющей смеси, накрывают покровным стеклом, после чего клетки разгоняют легким нажимом ногтя в один слой и покровное стекло заклеивают густым канадским бальзамом. Просветляющую среду (смесь) готовят иэ 1/Э глицерина и 2/3 концентрированного водного раствора хлоралгидрата 2.Однако этот способ обладает рядом недостатков. Намачивание семян в касторовом масле отрицательно сказывается на их прорастании; материал (корешки), как правило, давится неудовлетворительно, в результате чего клетки под покровнъм стеклом распластываются неравномерно, отчасти разрушаются, налегают друг на друга, хромосомы окрашиваются монотонно в темно- фиолетовый, почти черный цвет, беэ четкого. выявления морфологическнх признаков и распологаются в метафаэ"ных пластинках скученно, не в одной плоскости; во многих случаях препараты оказываются в значительной степени загрязненными капельками жиРа и .жироподобных веществ. Приготовление более или менее удачного препарата по этому способу носит весьма случайный характер.Целью изобретения является улучшения качества препаратов.Поставленная цель достигается тем, что в способ приготовления давленных препаратов хромосом хлопчатника, включающий фиксацию корешков по Левитскому, обработку раствором едкого натра, окрашивание в ацето-железогематоксилине, включают следующие операции: корешки, зафиксированные по Левитскому (1 1), промытые и обезвоженные до 70%-ного этанола, обрабатывают непосредственно или после пост- фиксации по Карнуа (6:3:1) 1 нраствором едкого натра, промывают дистиллированной водой 20-30 мин,окрашивают в ацето-железо-гематоксилине при 29- 33 С в течение от 1,5 до 24 ч, отмы- .овают от излишков красителя дистиллированной водой 20-30 мин, после чего кончики окрашенных корешков частично мацирируют с помощью цитазы, промывают дистиллированной водой и приготовляют давленые препараты с использованием в качестве просветляющей среды 45%-ной уксусной кислоты.Корешки обрабатывают 1 н. Раст( вором едкого натра в течение 1-3 чопри температуре 25-30 С или 15-25 мин при 60 С.При частичной мацерации кончики окрашенных корешков выдерживают в цитазе в плотно закрытом сосуде .в тео чение 1,5-7,0 ч при 20-25 С или одних-трех суток при 3-7 С.П р и м е р. Семена хлопчатника пяти видов проращивают в термостате в чашках Петри на увлажненной фильтровальной бумаге при температуре 29-30 С. По достижении корешками дли- ны 6-15 мм лучшие из них отделяют от проростков и погружают в свежеприготовленную смесь Левитского, состоящую из равных частей 1 ,-ной хромовой кислоты и 4 -ного формальдегида, Фиксация корешков длится 24 ч. После фиксации корешки промывают в проточной воде 3 ч, обезвоживают поочередно в 30-, 50- и 70 -ных растворах этанола по 10-15 мин. В 70 .-ном этаноле до приготовления давленых препаратов корешки можно хранить несколько суток в холодильнике, что необязательно.Далее: 1) корешки дополнительнофиксируют (постфиксация) по Карнуа(6:3:1) в течение 20 ч;2) промывают последовательно в 96 и 70 -ных растворах этанола по 10 мин:3) обрабатывают 1 н. раствором едо1 о кого натра при 60 С 20 мин; даннуюобработку рекомендуется проводить внебольшом объеме (4-5 мл) раствора щелочи в маленьком тонкостенном сосудес пробкой в термостате при 60 С в ка мере; вместо этого корешки можно обрабатывать 1 н. раствором едкого натра при 25-30 С в течение 1-3 ч;4) промывают в 5-6 сменах дистиллированной воды при комнатной температуре 25 мин;5) слегка обсушивают фильтровальной бумагой, убрав влагу с их поверхности;6) выдерживают в свежефильтрованном через бумажный фильтр ацето-железо-гематоксилине при 29-30 С 20 ч;о7) отмывают от излишков красителядистиллированной водой 30 мин; в этовремя удаляют ненужные части, оставляя кончики корешков длиной 1,21,5 мм;8) помещают кончики корешков вкаплю цитазы в маленьких .плотно закрытых сосудах (фарфоровых тиглях,закрываемых корковой пробковой пробкой) при 25 С на 1,5-7,0 ч;9) полощут в дистиллированной воде 3-т 5 мин;10) расщепляют каждый корешок вводе, преимущественно вдоль, на триаочетыре части;11) полощут каждую часть корешкаотдельно в 45 -ной уксусной кислоте,помещают в свежую каплю этой кислотына предметном стекле, накрывают покровным стеклом, приготавливают давленый препарат.Ацето-железо-гематоксилин готовили по способу: 4 г гематоксилинарастворяют в 100 мл 45 -ной уксуснойкислоты в колбе, затем добавляют 1 гжелезо-аммонийных квасцов. Колбу закрывают неплотно ватной пробкой иоставляют в светлом теплом (26-30 С)оместе на шесть-семь суток для созре вания красителя. Содержимое колбы ежедневно несколько раз взбалтывают.Притемпературе ниже 26 С созревание может длиться более семи суток. 1.ослеФормула изобретения 15 20 25 30 Составитель Л. МарченковаРедактор И. Нестерова Техред Т,Иаточка Корректор Е. Рошко Тираж 703 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам Изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Заказ 9780/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 5 8803 созревания краситель фильтруют через бумажный фильтр и хранят в холодильнике. Краситель сохраняет свои красящие свойства более месяца. Перед употреблением краситель взбалтывают и фильтруют через бумажный фильтр.%Приготовленные по предлагаемому способу давленые препараты имеют интенсивно окрашенные хромосомы с четко выраженными морфологическими призна О ками. 1. Способ приготовления давленых препаратов хромосом хлопчатника, включающий фиксацию корешков по Левитскому, обработку раствором едкого натра, окрашивание в ацето-железо-гематоксилине, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью улучшения качества препаратов, корешки, зафиксированные по Левитскому (1:1), промытые и обезвоженные до 707-ного этанола, обрабатывают непосредственно или после постфиксации по Карнуа (6:3:1) 1 н. раствором едкого натра, промывают дистиллированной водой 20-30 мин, окрашивают в ацето-железо-гематоксили 64 6не при 29-33 фС в течение от ,5 до24 ч, отмывают от излишков красителядистиллированной водой 20-30 мин,после чего кончики окрашенных корешков частично мацерируют с помощьюцитазы, промывают дистиллированнойводой и приготовляют давленые препараты с использованием в качестве просветляющей среды 453-ной уксуснойкислоты,2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, корешки обрабатывают 1 н. раствором едкого натрав течение 1-3 ч при температуре 2530 С или 15-25 мин при 6 д С.3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и -ч а ю щ и й с я тем, что, при частичной мацерации кончики окрашенныхкорешков выдерживают в цитазе в плотно закрытом сосуде в течение 1,57,0 ч при 20-25 С .или одних-трех суток при 3-7 О С,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М., "Колос", 1974,с. 119-27, 176-181.2. "Цитология и генетика", т. 5,В 2, 1971, с. 184-185 (прототип).