Способ контроля катализируемого аспартазой процесса полуения l-аспарагиновой кислоты

В,Э.Калнс, А.А П.Я.Пуриньщ, ЭС.М.Мал Хагеидорф, Г.А.Янкевиц, О,З.Скро ВНЕ ГАВЭР ИЛЪ щ ей и А.К.Арен(54) СПОСОБ КОНТРОЛЬ КАТАЛИЗИРУЕМОГО АСПАРТАЗОЙ ПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ (.-АСПАРАГИЙОВОЙ КИСЛОТЫ Изобретение относится к новому способу контроля реакций получения аспарагнновой кислоты, в частности к способам контроля реакции получения -аспарагиновой кислоты при катализе аспартазой.Известен способ контроля процесса превращения фумаровой кислоты в Е-аспарагиновую под действием аспартазы, согласно которому время от времени берут образец контактирующей с аспартазой реакционной смеси, содержащей фумарат и ионы аммония, разбавляют.его водой н на спектрофотометре измеряют зависимую от концентрации фумарата степень погло. щения ультрафиолетового света при 240 нм полученным раствором. С помощью предварительно составленного калибровочного графика определяют концентрацию фумарата и степень превращения его в аспарат. На основании ряда таких определений просле.живают ход процесса 11. Однако известный способ обладаетсущественными недостатками, заключающимися в значительной затратевремени на осуществление контроля(около четверти часа только на одно определение) и в отсутствиивозможности осуществления своевременного непрерывного контроля реакции, так как контроль ведется наосновании анализа отбираемых вручную проб реакционной смеси.Недостатком известного методаявляется и то, что контроль дает инфореащао, относящуюся не к текуще- ,му, а к проаедвему моменту времени,что также ограничивает возможностисвоевреиеияого оперативного регулирования хода щюцесса.Цель изобретения -.интенсификация процесса,Указаипая щель достигается тем,что согласно способу контроля катализируемого аспартазой процессаполучения Е-аспарагиновой кислоты,85715 Состав СопротивлениеОм (прииспользовании Уменьшение Показа Удельная ия лек 3" ФОмсмтропроводност ( ), Омсм ячеики конста тойК=5,см 98 э 33 Оьбб 8 ,50 0,50 7 ,80 0,20 3 90 0,10 1 2 2 222 О,0 О путем измерения превращения Фумарата в аспархат измерение превращения Фумарата в аспартат осуществляют по показаниям анализатора электропроводности.Прослеживание реакции основывается на том, что электропровод- ность исходного содержащего ионы аммония раствора Фумарата примерно вдвое превышает электропроводность раствора аспартата, получаемого при завершении реакции, и поэтому в" ходе реакции электропроводность уменьшается. Ири этом в течение процессаудельная электропроводность линейно зависит от концентрации Фумарата, используемого и реакции. Процесс ведется беэ отбора проб, а результаты, не затрачивал времени на анализ, считывают со шкалы анализатора электропроводности, При этом получают непрерывные зависящие от глубины реакции показания, что обеспечивает непрерывный автоматический контроль кода реакции, причем результат анализа всегда относится к данному моменту времени. Поэтому на основе результа" тов анализа возможно своевременное оперативное регулирование хода процесса, Кажцое соответствующее данной злектропроводности показание обеспечивается электрическим сигналом определенной силы, которая зависит от концентрации фумарата в реакционной смеси, Поэтому, с одной стороны, показания анализатора электропровод- кости можно записывать регистрирующим прибором 1,самописцем) и таким образом регистрировать глубину реакции ыа каждый момент прошедшего времени, записывая весь ход процесса.С другой стороны, непрерывно получаемый электрический сигнал, силакоторого зависит от глубины реакции,непосредственно может быть использован для автоматизации регулированияхода процесса,1 ОП р и м е р 1. Готовят 20 лМраствора Фумаровой кислоты, доведенного до рН 8,4 при 18 оС водным аммиаком и содержащего 0,003 М двухлористого, марганца, и 50 мл 1 М раствора . - аспарагиновой кислоты, доведенного до рН 8,4 при 18 С воднымаммиаком и содержащего 0,003 М двухлористого марганца. Снимают показания анализатора электропроводностис фиксированной чувствительностьюпри последовательном термостатировании при 37 С детектора прибора в растворе Фумарата, растворе аспартатаи их смесях, имитирующих различныестадии превращения Фумарата в аспартат. Кроме того, имеют сопротивлениеи рассчитывают удельную злектропроводность этих растворов. В табл. 1 приведены показания и результаты, полу- ЗОченные при использовании по прописиФирмы в качестве анализатора электропроводности прибора "Сопдцсо 1 ухег"Шведской Фирмы 1.КВ установленноготак, что в случае 1 И фумарата получаз 5 ют показание 100, а в случае 1 Маспартата " 0 (детектор - ячейка сконстантой К 5,9 см ).Т а б л и а 1 0 40,4 0,1 й 7 042)5 Оф 139 Оь 008 48,7 0,121 0,026 54,2 0,109 0,038 69,5 0,085 0,062 75,6 0,078 0,069 84 25 0,070 0,0778571 Концентрация аспарагиново 7 0,2 ислоты,По 15,6 ч от начала реакции хромаеским методом в реакционнойЭЭ ределяют 0,99 М концентрацию новой кислоты. При продолжаазмешивании реакционную смесь ют до рН 4,8 с помощью конванной серной кислоты, добавей 20 г активированного уг- КАД, нагревают до 80 оС и отывают через три слоя фильтробумаги. Слой угля на фильтре т деминерализованной водой, с присоединенной промывной коло 30 л) подкисляют конценной серной кислотой до рН 2,66 вшуюся при этом суспензию тографич смеси оп аспараги ющемся р Формула изобретени мог з Способ контроля катали аспартазой процесса нолуч парагиновой кислоты, вклю рение превращения фумарат тат, отличающий что, с целью интенсификац са, измерение превращения в аспартат осуществляют п ниям анализатора электропИсточники информа принятые во внимание при1, 81 осЬев. Вормуз. А 483 (1), 193-202 (прототип- ас ния ающ 1 зме подкисл центрир ляют к ля марк фильтро вальной промыва фильтра водой ( трирова и получ в ас тем о фумарат показа во ии,кспеса,Заказ 43 нного коми ений и от 35, Рнушс Подписнотета СССРрытий 36 Тираж ВНИИПИ Государстпо делам изобр 130.55, Москва,кая н Патент, г. У Проектная илиал ППП ор Пользуясь выявленной в таблице зависимостью показаний анализатора электропроводности от степени превращения фумарата в аспартат, дополнительно размечают шкалу прибора в единицах концентрации аспарагиновой кислоты.К 20 л 1 М фумарата аммония при 37 С добавляют при размешивании 40 мл экстракта Е. со 11 Ксо средней 10 аспартазной активностью 223 мкмоль- аспарагиновой кислоты в минуту на 1 мл, В размешиваемый и термостатируемый при 37 С раствор 1 М фумарата аммония погружают ячейку15 кондуктолайзера с константой 5,9 см и ход реакции превращения 1 М фумарата аммония в аспартат прослеживают по размеченной шкале. Результаты, полученные при прослеживании 20 .реакции, приведены в табл, 2,15 баспарагиновой кислоты 16 ч размешивают и охлаждают спиралью с текущейводопроводной водой.Полуяеиную аспарагиновую кислотуотфильтровывают через слой бельтинга, промывают на Фильтре охлажденнойдо 10 С деминерализованной водой доотсутствия сульфат- ионов и затем4 л спирта, После высушивания при60-70 С получают 2,195 кг (827. выхода) 1. - д .парагиновой кислоты.Р 3 +24( =1; 5 и НС 1)Н р и м е р 2. 6 мл ферментногораствора (полученного смешиванием0,95 мл экстракта Е, со 1 Кс39 мл воды и 0,015 г бычьевого альбумина), налитого с вытеснением воздуха в закрытый с обоих сторон сплющенный целлофановый рукав 6.4,5 см,выдерживают при 37 ф 6 с 35 мл 1 М фумарата аммония. Для прослеживанияреакции берут пробы реакционной смеси, и каждый раз термостатируя пробус детектором кондуктолайзера (ячейкойс константой 5,9 см ) прц 37 С, соойкалы прибора считывают концентрациюаспаргиновой кислоты, определяют,что через 1 сут достигнута 0,86 М,а через 5 сут 0,97 М концентрацияаспарагиновой кислоты (хроматографически через 5 сут определена 0,95 Мконцентрация аспарагиновой кислоты),